肝細胞生長(cháng)因子對子宮內膜癌細胞增殖影響的實(shí)驗研究論文
目的 觀(guān)察肝細胞生長(cháng)因子（HGF）對子宮內膜癌細胞HEC?2B增殖的影響及子宮內膜癌細胞HEC?2B中HGF受體C?met的表達，了解HGF對子宮內膜癌細胞的作用及其機制。方法 體外培養人子宮內膜癌細胞HEC?2B，用RT?PCR的方法檢測HEC?2B中HGF受體C?met有表達。對HEC?2B進(jìn)行24 h血清饑餓后用不同劑量的HGF作用于HEC?2B。用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法(MTT法)分析細胞的增殖力，用流式細胞儀檢測細胞的增殖周期。結果 C?met在HEC?2B細胞中穩定表達，HGF促進(jìn)細胞的增殖，并在一定的范圍內有劑量依賴(lài)關(guān)系，各處理組與對照組相比，P<0.05。當HGF濃度達到60 ng· mL-1時(shí)，增殖水平較對照上調約1.9倍。結論 HGF/C?met能夠在體外促進(jìn)子宮內膜癌細胞的增殖。Abstract:Objective To study the effects of hepatocyte growth factor on endometrial cancer cells, detect the alterations of cell proliferation and expression level of HGF receptor C?met and understand the molecular mechanism. Methods Endometrial cancer cell line, HEC?2B was cultured in vitro. The expression level of C?met in HEC?2B was determined with RT?PCR. HEC?2B was treated with HGF at different doses. Cell proliferation was analyzed with MTT assay. Cell cycle distribution was examined with FACS. Statistical evaluations were conducted using t?test. Results C?met was expressed in HEC?2B cells. Compared with controls, HGF could promoted the proliferation of HEC?2B in a dose?dependent manner (P<0.05). Treatment with 60 ng· mL-1 HGF increased the proliferation level by 1.9 fold. Conclusion C?met was expressed stably in HEC?2B cells. HGF/C?met system promoted the formation, development and proliferation of endometrial cancer cells in vitro.
Key words:endometrial cancer cell; hepatocyte growth factor; hepatocyte growth factor receptor
子宮內膜癌是女性生殖道常見(jiàn)三大惡性腫瘤之一，近20年來(lái)在世界范圍內子宮內膜癌發(fā)病率有上升趨勢。肝細胞生長(cháng)因子(HGF)是一個(gè)多功能生長(cháng)因子。HGF的單一受體C?met是一跨膜蛋白，由原癌基因C?met編碼。在許多惡性腫瘤中C?met被過(guò)表達［1-6］。HGF/C?met與子宮內膜癌的關(guān)系卻鮮有報道。本研究通過(guò)觀(guān)察子宮內膜癌細胞中C?met的表達及HGF對子宮內膜癌細胞的作用，旨在為臨床以HGF／C?met為靶點(diǎn)治療子宮內膜癌提供理論基礎。
1 材料與方法
1.1 試劑與細胞株
子宮內膜癌細胞株HEC?2,購自中科院細胞庫;RNase、胰蛋白酶、DMEM 培養基、Trizol、逆轉錄酶Superscript Ⅲ為Invitrogen公司產(chǎn)品;優(yōu)質(zhì)胎牛血清，Gibco公司;HGF購自R&D， Agarose 、G418 由Sigma公司提供。PCR用酶SYBR Green PCR Master Mix購自ABI公司。EPICS AL TRA流式細胞儀，美國B(niǎo)eckman Coulter公司提供。
1.2 HEC?2B細胞的體外培養與誘導
將細胞以1×105/cm2接種于細胞培養瓶中，每瓶加入5 mL含10%(φ)FBS（胎牛血清）的DMEM；培養24 h后，換5%FBS的DMEM饑餓培養12 h，分別加入濃度為20、40、60、80、100ng·mL-1的HGF進(jìn)行處理，設置空白組不進(jìn)行誘導，培養基中FBS的濃度改成5%；培養48 h后收集細胞。
1.3 PCR
用PBS清洗細胞，用Trizol法抽提RNA，并常規檢測RNA的純度及完整性。反轉錄，用人的β?actin基因檢測反轉錄是否成功。PCR條件為：94 ℃ 5 min 激活聚合酶，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃45 s，共33循環(huán)，72 ℃保溫10 min，4 ℃保溫10 min。采用瓊脂糖凝膠檢測的方法進(jìn)一步驗證。Realtime定量PCR條件為：95 ℃ 5 min 激活聚合酶，95 ℃變性15 s，57 ℃退火5 s，72 ℃ 25 s，共45循環(huán)。采用ABI7300系統進(jìn)行檢測，每個(gè)循環(huán)結束檢測熒光強度。融解曲線(xiàn)分析：每分鐘讀1次，檢測范圍為55 ℃ 到 95 ℃。熒光強度檢測采用動(dòng)態(tài)跟蹤的方法，自動(dòng)測出Ct值（每個(gè)反應管內的熒光信號到達所設定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數），用2?△△Ct 表示實(shí)驗組目的基因的表達相對于對照組的變化倍數，并采用瓊脂糖凝膠檢測的方法進(jìn)一步驗證。Β?actin引物序列如下：上游引物 5′?gctct tttcc agcct tcctt?3′,下游引物 5′? tgatc cacat ctgct ggaag?3′。C?met檢測引物序列：上游引物5′?ttcaagtagc caaagcgatg?3′,下游引物 5′?gtgtttacgtcaggataag?3′ 。C?met檢測引物序列：上游引物5′?ttcaagtagc caaagcgatg?3′,下游引物 5′?gtgtttacgtcaggataag?3′,產(chǎn)物大小300 bp。
1.4 用MTT法檢測細胞增殖能力
取對數生長(cháng)期的細胞，用含0.25%(φ)胰酶消化，懸浮于適量培養基中，通過(guò)細胞計數將其濃度調整到4×104個(gè)細胞/mL。將此細胞懸液以100 μL/孔均勻接種到細胞培養板上，置于37 ℃，5％CO2的培養箱中，培養24 h后，換成稀釋液，繼續培養24 h，使細胞饑餓。分組加藥，分別將含20、40、60、80、100 ng· mL-1HGF的培養液100 μL加入細胞培養孔中，每個(gè)稀釋度做4個(gè)復孔，設立空白對照組。加樣后置于37 ℃，5％CO2的培養箱中繼續培養44 h，每孔加入20 μL MTT染色液，繼續培養4 h；棄去培養液，加入抽提液150 μL/孔，置于微量振蕩器張充分振勻以抽取染料，振動(dòng)15 min。以570 nm為檢測波長(cháng)，630 nm為參考波長(cháng)，用酶標儀測定各孔的吸光值（A）
1.5 流式細胞檢測
消化并收集細胞，每檢測管中(0.5～1)×106細胞，PBS清洗一遍，離心去上清，轉速1 000 r/ min，5 min，沿管壁緩慢加入終濃度70％(φ)的乙醇，混勻，－20 ℃ 固定過(guò)夜，1 000 r/min 離心5 min去上清，PBS清洗一遍，加入Rnase抑制劑50 μL，加入50 μg/mL的PI染料混勻，4 ℃ 避光30 min，上機檢測。
1.6 統計學(xué)方法
采用t檢驗，P<0.05 為差異有顯著(zhù)性。
2 結 果
2．1 HEC?2B的培養與傳代
HEC?2B為起源于子宮內膜癌的細胞系，在10% 胎牛血清( Fetal Calf Serum, FCS)，DMEM培養基，5％ CO2，37℃的培養條件下，細胞生長(cháng)良好，其形態(tài)見(jiàn)圖1所示。
將上述總RNA逆轉錄后，采用PCR的方法進(jìn)行擴增，電泳后進(jìn)行EB染色（圖3），發(fā)現得到條帶的大小與預計的300 bp相符合，表明在HEC?2B細胞中具有C?met基因的轉錄。
經(jīng)反復后傳5、10、15、20、25代后，抽提總RNA，各樣品之間RNA的量相近，C?met的轉錄水平基本維持不變。各組之間比較，P>0.05,差異無(wú)顯著(zhù)性。結果見(jiàn)圖4、表1所示。
表1 RT?PCR測得C?met表達水平（略）
2．3 HGF對HEC?2B的影響
2．3.1 MTT法檢測結果
20 ng· mL-1的HGF即能夠明顯促進(jìn)HEC?2B的增殖，并表現為劑量依賴(lài)關(guān)系，當HGF濃度達到60 ng·mL-1時(shí)，增殖水平較對照上調約1.9倍，此后有所下降，100 ng·mL-1的HGF仍能夠明顯促進(jìn)HEC?2B的增殖（圖5）。
2．3.2 流式細胞檢測結果
用20 ng·mL-1HGF處理HECT?2B細胞，即可使處于G1細胞比例減少，處于G2+S期細胞增多，當HGF濃度增加到60 ng·mL-1時(shí)，G1期細胞最少，G2+S期細胞最多。增殖指數（proliferation index, PI）可以用來(lái)反映細胞的增殖狀況，各濃度的HGF處理組都可以明顯促進(jìn)HECT?2B細胞的增殖。結果見(jiàn)圖6與表2所示。表2 HGF處理對HEC?2B細胞增殖周期的影響（略）
3 討 論
肝細胞生長(cháng)因子(HGF)首先從部分肝臟切除的大鼠的血清中提取，由于其對肝細胞具有強的絲裂原作用，因此命名為肝細胞生長(cháng)因子［7］。HGF的單一受體C?met是一跨膜蛋白，由原癌基因C?met編碼［5］。許多文獻報道C?met在較多腫瘤中都有較高表達，這些腫瘤包括：卵巢癌［1］、腎癌［2］、膀胱癌［3］、乳腺癌［4］、胰腺癌［5］與前列腺癌［6］。但HGF/C?met在子宮內膜癌發(fā)生發(fā)展中所起作用卻鮮有報導。
正常細胞的生長(cháng)過(guò)程是一種有控生長(cháng)，且會(huì )逐步分化；腫瘤細胞則生長(cháng)失控化，幼稚化。腫瘤細胞體的不穩定性和非整倍體細胞的出現即是由這種細胞周期調節機制失控所造成的［7］。這種失控也使腫瘤細胞在傳代時(shí)可能發(fā)生一些自發(fā)的重組而導致一些基因的啟動(dòng)子丟失，使這些基因不表達或表達量減少。本實(shí)驗檢測了HEC?2B細胞中C?met的表達情況，發(fā)現C?met的mRNA能夠持續存在于HEC?2B細胞中。在體外持續的傳代多達25次，仍能夠檢測到C?met的mRNA，而且數量沒(méi)有明顯的變化，充分說(shuō)明在很長(cháng)的時(shí)間范圍內，C?met的啟動(dòng)子能夠被持續穩定地激活，說(shuō)明該基因表達對HEC?2B具有較為重要的生理或病理學(xué)意義。 本實(shí)驗結果表明：MTT及流式細胞儀的結果均顯示：20 ng·mL-1的HGF促進(jìn)HEC?2B的增殖，當HGF濃度達到60 ng·mL-1時(shí)，促增殖作用最強，此后作用稍減弱，HGF濃度達到100 ng·mL-1時(shí)仍有一定促增殖作用，在一定范圍內表現為劑量依賴(lài)關(guān)系�？紤]與HGF是通過(guò)與受體結合來(lái)起作用有關(guān)：當HGF與受體結合未達到飽和時(shí)，促增殖作用隨HGF濃度的增加而增強；當與受體結合達飽和時(shí)，增殖作用便不呈現劑量依賴(lài)性。內膜癌細胞中有C?met的表達，HGF能有效促進(jìn)內膜癌細胞增殖。在體內，HGF是否與子宮內膜癌的發(fā)生、發(fā)展直接相關(guān)，問(wèn)題的關(guān)鍵在于體內是否存在HGF直接作用于子宮內膜癌組織的可能性。
研究表明，在體內HGF可由子宮內膜上皮下層的基質(zhì)細胞來(lái)分泌表達［8］ 。 HGF對子宮內膜上皮細胞的作用是以旁分泌的方式進(jìn)行的。這樣就給子宮內膜癌的發(fā)生發(fā)展提供了營(yíng)養支持。Yoshida等［9］認為，腫瘤細胞能夠分泌堿性成纖維細胞生長(cháng)因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)，而基質(zhì)細胞膜上有bFGF的受體，一旦與配體結合后，即能夠促進(jìn)HGF的表達上調，反過(guò)來(lái)促進(jìn)腫瘤細胞的生長(cháng)。
本研究提示，HGF/C?met能夠在體外促進(jìn)子宮內膜癌的發(fā)生、發(fā)展與增殖。研究發(fā)現C?met是一個(gè)極有希望的治療靶點(diǎn)，一些HGF的拮抗劑已進(jìn)入治療腫瘤的實(shí)驗階段［10］。這一結果為通過(guò)阻斷 HGF/C?met系統的表達或信號轉導通路治療內膜癌提供了新思路。
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