CCR3在哮喘豚鼠模型肺和骨髓中的表達及意義
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【摘要】 目的 觀(guān)察哮喘豚鼠肺和骨髓組織嗜酸粒細胞趨化因子受體3(CCR3)及嗜酸粒細胞(EOS)不同時(shí)相表達的變化, 探討哮喘發(fā)病的可能機制。方法 用卵白蛋白(OVA)和生理鹽水致敏法制備豚鼠哮喘和對照模型, 分為正常對照組(N)及哮喘組(A、B、C、D、E)，每組8只，于激發(fā)后30 min，6 h，12 h，24 h，48 h處死，瑞氏染色計數骨髓涂片和外周血涂片中EOS比例,免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測骨髓中CCR3的表達;制備豚鼠肺組織病理標本, 蘇木精-伊紅染色,免疫組化檢測肺組織中CCR3的表達。結果 ①哮喘組骨髓和外周CCR3及EOS表達明顯增加;②OVA激發(fā)后,骨髓和外周CCR3及EOS表達：30 min變化不明顯，6 h，12 h達到峰值，24 h開(kāi)始下降，48 h恢復正常水平;③骨髓的變化早于外周，CCR3的表達早于EOS的增多，且CCR3和EOS呈線(xiàn)性相關(guān)。結論 哮喘豚鼠肺組織和骨髓之間存在骨髓EOS細胞到循環(huán)再到肺組織的通路，CCR3表達增強, 為EOS從骨髓快速募集到肺組織提供了可能。
【關(guān)鍵詞】 支氣管哮喘 CCR3 EOS 骨髓 豚鼠
哮喘是多種細胞(如嗜酸粒細胞、肥大細胞、淋巴細胞、中性粒細胞和氣道上皮細胞等)和細胞組分參與的氣道慢性炎癥疾患，哮喘氣道炎癥的特征性改變?yōu)槭人崃＜毎?EOS)的浸潤和活化。氣道黏膜下的 EOS主要來(lái)源于骨髓CD34+干細胞在某些信號(如eotaxin,IL-5)的驅動(dòng)下分化成熟為EOS，釋放入外周血，在多種趨化信號的引導下向肺內定向募集。這一現象意味著(zhù)從骨髓-循環(huán)-氣道，存在著(zhù)調控EOS定向遷移的信號通路。在EOS趨化、募集于肺組織內的過(guò)程中，嗜酸粒細胞趨化因子受體3(CCR3)起著(zhù)重要作用。本實(shí)驗探討哮喘發(fā)作時(shí)骨髓和氣道之間的調控EOS定向遷移信號通路;為臨床開(kāi)發(fā)治療哮喘新方法提供理論依據。
1 材料和方法
1.1 材料 雄性豚鼠48只, 體重(250±50) g,由徐州醫學(xué)院動(dòng)物中心提供。隨機分為對照組(N)、哮喘組(根據處死時(shí)間分為A、B、C、D、E組), 每組8只。雞卵白蛋白(ovalbumin, OVA,美國Sigma公司)、CCR3多克隆抗體及SABC免疫組化試劑盒(武漢Boster公司) 、奧林巴斯圖像采集系統、德國百瑞霧化器和自制霧化箱。
1.2 方 法
1.2.1 哮喘模型的建立 哮喘組于第1天腹腔注射抗原混懸液1ml (OVA 100 mg、氫氧化鋁200 mg) , 2周后將豚鼠放于自制霧化吸入箱內, 噴射霧化吸入10 g/L OVA 20 min,連續5天[1]。對照組于第1天腹腔注射1 ml生理鹽水, 2周后噴射霧化吸入生理鹽水20 min,連續5天。最后1次霧化吸入后，哮喘組A、B、C、D、E分別于30 min，6 h，12 h，24 h，48 h處死動(dòng)物,對照組12 h處死，取材并作相應測定。
1.2.2 骨髓和外周血EOS計數 于末次激發(fā)后,斷頸處死豚鼠, 取頸動(dòng)脈血制作血涂片。取兩側股骨, 去掉兩端骨骺, 剖開(kāi)骨干髓腔,以含肝素100 U/ml的生理鹽水溶液將骨髓細胞沖洗出, 4℃,1000 r/min離心5 min后，沉渣涂于多聚賴(lài)氨酸處理的玻片上，干燥后以40 g/L多聚甲醛固定30 min,-20℃保存備用。骨髓和外周血涂片用瑞氏染色, 隨機計數200個(gè)白細胞, 并計算其中EOS百分比。
1.2.3 骨髓細胞CCR3表達的檢測 采用SABC免疫組織化學(xué)法檢測骨髓中CCR3的表達。以兔抗大鼠CCR3 IgG為一抗, 以生物素化的羊抗兔IgG為二抗。取骨髓沉渣涂片, 按SABC免疫組化試劑盒說(shuō)明書(shū)處理。在光鏡下觀(guān)察結果,胞膜為棕黃色者為陽(yáng)性細胞, 在光鏡(×400) 下隨機選取5個(gè)視野, 計數陽(yáng)性細胞數占白細胞總數的比例, 結果以±s表示。
1.2.4 肺組織EOS計數及CCR3表達的檢測 無(wú)菌操作下切取部分肺組織,40 g/L多聚甲醛固定, 常規石蠟包埋、切片, 分別進(jìn)行H-E染色、CCR3免疫組化染色(嚴格按武漢Boster公司SABC試劑盒說(shuō)明書(shū)操作)。肺組織切片H-E染色后, 每張切片計數200個(gè)細胞, 計算其中EOS百分比。免疫組化計數方法: 光鏡下觀(guān)察胞膜著(zhù)棕黃色為陽(yáng)性細胞。每例選擇1張染色較好的切片, 顯微鏡下隨機選取5個(gè)高倍視野(×400) , 計數, 取每視野的均數, 結果以±s表示。
1.2.5 統計學(xué)處理 計量數據均采用±s表示，用 Stata7.0軟件對數據進(jìn)行t檢驗和相關(guān)分析，P<0.05為差異有統計學(xué)意義。
2 結 果
2.1 哮喘豚鼠氣道病理學(xué)改變 肺組織H-E染色光鏡下可見(jiàn)：與對照組相比，哮喘組大、中、小支氣管收縮,黏膜水腫，平滑肌增厚,上皮細胞腫脹,部分上皮細胞變性、壞死脫落,杯狀細胞增生,支氣管管腔狹窄甚至閉塞,黏液栓形成;支氣管周?chē)軘U張、充血,黏膜、黏膜下層及肺泡區有大量的炎癥細胞浸潤,主要為EOS、淋巴細胞、單核細胞;肺泡間隔增厚。激發(fā)后30 min上述改變不明顯，6 h,12 h肺組織病變最明顯，24 h,48 h逐漸恢復到正常肺組織表現。見(jiàn)圖1。
2.2 外周血涂片、骨髓細胞涂片及肺組織EOS計數 結果見(jiàn)表1�？梢园l(fā)現哮喘(豚鼠)激發(fā)后30 min，與對照組相比變化不大，且外周血EOS百分比稍有下降，但無(wú)統計學(xué)意義;6 h,12 h升高明顯(P<0.01);24 h開(kāi)始下降(P<0.05);48h基本恢復到正常水平。值得注意的是哮喘組不同時(shí)間點(diǎn)之間EOS也存在著(zhù)變化：6 h較30 min，EOS升高明顯(P<0.01);12 h較6 h,肺組織EOS變化不大(P>0.05),骨髓和外周血升高(P<0.05);24 h較12 h，48 h較24 h,EOS呈下降趨勢(P<0.01).可以看出在6 h,12 h時(shí)EOS增多最明顯，與氣道病理學(xué)改變相一致，24 h開(kāi)始下降，48 h回到正常水平。骨髓的變化先于肺和外周血，且持續的時(shí)間短。
2.3 肺組織和骨髓中CCR3蛋白的表達 結果見(jiàn)表2。 哮喘組肺組織和骨髓中CCR3 蛋白陽(yáng)性細胞呈棕黃色,主要定位于細胞膜。肺組織中，氣道黏膜、黏膜下層及血管周?chē)�、肺泡區有大量呈棕黃色的陽(yáng)性細胞,氣道黏膜上皮細胞、血管內皮細胞及平滑肌細胞也有CCR3蛋白表達,對照組在上述部位僅少量表達。骨髓細胞中,呈棕黃色CCR3 蛋白陽(yáng)性細胞大量表達于各階段Eos細胞表面，見(jiàn)圖2。不同之間點(diǎn)的表達趨勢和EOS的變化一致：與對照組相比骨髓及肺組織中CCR3 30 min時(shí)開(kāi)始升高(P<0.05); 6 h、12 h達到高峰(P<0.01);24 h開(kāi)始下降(P<0.05);48 h基本恢復到正常水平。哮喘組不同時(shí)間點(diǎn)之間CCR3表達也存在著(zhù)變化：6 h較30 min升高明顯(P<0.01);12 h較6 h,肺組織繼續升高(P<0.05),骨髓中持續高峰(P>0.05);24 h較12 h，48 h較24 h漸下降至正常水平(P<0.01)。骨髓先升高，肺組織隨著(zhù)變化，但持續時(shí)間長(cháng)于骨髓。 表1 對照組、哮喘組的EOS計數表2 肺組織和骨髓中CCR3 蛋白的表達2.4 肺組織和骨髓EOS表達與CCR3蛋白表達的關(guān)系 EOS表達與CCR3蛋白的表達存在著(zhù)線(xiàn)性關(guān)系：肺組織，r=0.93,P<0.01;骨髓，r=0.95,P<0.01。
3 討 論
CCR3主要由單一肽鏈組成的7個(gè)螺旋跨膜結構，屬于G 蛋白藕聯(lián)受體家族。CCR3 主要表達于EOS上，介導其遷移及脫顆粒反應。Shannon A 等[2]研究發(fā)現eotaxin及eotaxin-2 通過(guò)與CCR3的結合可以誘導部分CCR3內陷和EOS 的變形，有助于EOS 的活化和遷移。Joubert P 等[3]發(fā)現eotaxin 作用于氣道平滑肌細胞CCR3可誘導平滑肌細胞遷移和增殖，使細胞內Ca2+增高。Adachi T 等[4]發(fā)現支氣管上皮細胞表達CCR3 可激活和誘導有絲分裂原激活蛋白(MAP)活化和細胞因子的產(chǎn)生�？梢�(jiàn)CCR3無(wú)論在氣道炎癥還是重塑方面都起到了重要作用。本實(shí)驗發(fā)現哮喘時(shí)不但肺組織EOS浸潤明顯，CCR3表達增加，而且黏膜上皮細胞、平滑肌細胞上CCR3也有明顯表達，平滑肌增厚，和既往研究一致。
以往研究表明, 在過(guò)敏性哮喘患者的骨髓中, 成熟和非成熟的EOS CCR3表達水平顯著(zhù)升高[5]。Lamkhioued等[6]研究證實(shí),CCR3 可表達于骨髓CD34+造血細胞表面,在體內外eotaxin 與CCR3 結合后均表現出明顯的趨化活性,促使骨髓中CD34+細胞產(chǎn)生增多。并且單獨或與IL-5協(xié)同作用可以使骨髓CD34+祖細胞定向分化為EOS，并向外釋放、募集[7]。本實(shí)驗發(fā)現哮喘組骨髓CCR3表達明顯高于對照組，與EOS各級細胞呈線(xiàn)性相關(guān)，并且CCR3的表達高峰在6 h,早于EOS增加，釋放的高峰時(shí)間12 h，說(shuō)明在某些因子的作用下，骨髓祖細胞表達CCR3，進(jìn)一步使EOS分化、釋放增多，利于炎癥的發(fā)展。
近年研究的重點(diǎn)傾向于骨髓、肺組織、循環(huán)之間的關(guān)系，以便更好地為治療哮喘開(kāi)闊思路。本實(shí)驗發(fā)現無(wú)論肺組織還是骨髓在哮喘激發(fā)初始時(shí)變化不明顯，但是外周血EOS呈下降趨勢，考慮為向肺內募集量大于骨髓釋放量;在6 h后，骨髓CCR3和EOS均明顯增加，外周血EOS增多，肺內表達增多，12 h達到高峰，24 h開(kāi)始下降，說(shuō)明伴隨骨髓干細胞CCR3表達增加，EOS增多、釋放，外周的EOS也在變化。證明在骨髓到外周血再到肺組織存在著(zhù)密切的細胞信號環(huán)路聯(lián)系。如果能切斷這方面的環(huán)路，如通過(guò)抑制CCR3的表達，或者給于其拮抗劑，將對哮喘的治療有很重要的意義。
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