HPLC法測定炔雌醇脂質(zhì)體的含量及包封率論文
目的 建立測定炔雌醇脂質(zhì)體的含量及包封率的方法。方法 采用HPLC法，以Agilent HC?C18柱(4.6 mm× 250 mm,5 μm)為色譜柱，流動(dòng)相為甲醇?水(體積比70∶30)，柱溫為室溫，流速為1.0 mL·min-1，紫外檢測波長(cháng)為281 nm。結果 炔雌醇與卵磷脂、溶劑峰能有效分離，炔雌醇在2 ～20 μg·mL-1范圍內線(xiàn)性關(guān)系良好（r=0.999 7, n=10），回收率在98.0%～102.0%之間。結論 所建立的方法簡(jiǎn)便、準確、靈敏度高、方法可靠，可作為炔雌醇脂質(zhì)體的含量及包封率的質(zhì)量控制方法。Abstract:Objective To establish an HPLC method for the analysis of ethinylestradiol content and entrapment efficiency of ethinylestradiol liposomes.Method Samples were analyzed on an Agilent HC?C18 column（4.6 mm× 250 mm，5 μm）using methanol?water（70∶30）as mobile phase. The flow rate was 1.0 mL·min-1 and detection wavelength 281 nm.Results Ethinylestradiol had a good linearity over the range of 2～20 μg·mL-1 (r=0.999 7, n=10), the average recovery was between 98.0% and 102.0%. Conclusion This method is simple, accurate and sensitive for the quality control of the liposomes.
Key words:HPLC; ethinylestradiol liposomes; ethinylestradiol; entrapment efficiency
炔雌醇又名乙炔雌二醇，為3?羥基?19?去甲?17α?孕甾?1，3，5（10）?三烯?20?炔?17?醇�；瘜W(xué)結構式為［1］：
炔雌醇作為雌激素類(lèi)藥，其對下丘腦和垂體有正、負反饋作用，小劑量時(shí)可刺激促性腺素分泌，其活性是雌二醇的7～8倍，己烯雌酚的20倍，臨床多用于月經(jīng)紊亂，如閉經(jīng)、月經(jīng)過(guò)少、功能性子宮出血、絕經(jīng)期綜合征、子宮發(fā)育不全、前列腺癌等疾病的治療，具有療效確切、價(jià)格適中等優(yōu)點(diǎn)，易被廣大婦女所接受。但其亦有許多副反應，如惡心、嘔吐、陰道出血、誘發(fā)子宮內膜癌等［2,3］，因而嚴重地影響到病人的用藥安全。將其制備成脂質(zhì)體，可以有效地減少給藥次數和給藥量，提高生物利用度，降低毒副作用。
本文制備了炔雌醇脂質(zhì)體，并采用反相高效液相色譜法測定炔雌醇脂質(zhì)體的含量和包封率［4,5］。實(shí)驗結果表明，該方法準確可靠，可作為炔雌醇脂質(zhì)體質(zhì)量控制的一個(gè)有效手段。
1 儀器與試藥
Waters 2695高效液相色譜儀，Waters 2996紫外檢測器，Waters 717自動(dòng)進(jìn)樣器，Waters Millennium色譜工作站；Agilent HC?C18(4.6 mm× 250 mm, 5 μm) 色譜柱；日立U?3010/3310紫外可見(jiàn)分光光度計(北京天美公司)；Nicomp 370激光散射粒徑儀（ 加拿大Santa Burbara公司），擠壓器(加拿大Lipex Biomembranes公司) 。甲醇(色譜純，SK Chemicals)；炔雌醇原料藥（上海醫藥集團有限公司）；精制蛋黃卵磷脂egg phosphatidylcholine (西安力邦制藥有限公司，質(zhì)量分數98%) 。
2 方法與結果
2.1 脂質(zhì)體的制備
采用薄膜法制備炔雌醇脂質(zhì)體［6-8］：按藥物含量15%～30%（摩爾比）稱(chēng)取炔雌醇原料藥和蛋黃卵磷脂，將其溶于適量甲醇?氯仿（體積比1∶2）中，漩渦混合均勻后，50 ℃下氮氣吹干，再用真空泵將剩余有機溶劑抽干。加入磷酸鹽緩沖液漩渦混合，高速剪切1～2 h，用脂質(zhì)體擠壓器將其依次經(jīng)過(guò)400、200、100 nm聚碳酸鹽濾膜擠壓，即得。獲得的脂質(zhì)體的平均粒徑都在110 nm左右，電鏡觀(guān)察，呈現均勻的圓球狀。
2.2 色譜條件
色譜柱：Agilent HC?C18柱(4.6 mm× 250 mm,5 μm)；流動(dòng)相：甲醇?水(體積比70∶30)；柱溫：室溫；流速為1 mL·min-1；紫外檢測波長(cháng)為281 nm；進(jìn)樣量50 μL。
2.3 干擾試驗
稱(chēng)取20 mg炔雌醇置10 mL容量瓶中，加入甲醇?水（體積比70∶30）溶解并稀釋至刻度，得炔雌醇對照品溶液。分別精密吸取空白脂質(zhì)體及炔雌醇脂質(zhì)體各0.2 mL，用甲醇?水（體積比70∶30）稀釋至2.0 mL破乳，振蕩混勻，分別得到空白脂質(zhì)體溶液和脂質(zhì)體炔雌醇溶液。將上面制備的3種溶液過(guò)0.22 μm有機濾膜，各取50 μL進(jìn)樣分析，得色譜圖。結果表明，卵磷脂和炔雌醇的保留時(shí)間相距很大，卵磷脂對炔雌醇的測定無(wú)干擾。炔雌醇對照品和炔雌醇脂質(zhì)體的峰面積基本相同，證明卵磷脂沒(méi)有吸附炔雌醇，也沒(méi)有改變炔雌醇的性質(zhì)和結構，見(jiàn)圖1。
2.4 線(xiàn)性關(guān)系考察
取炔雌醇對照品溶液，按上述色譜條件，分別進(jìn)樣1，2，3，4，5，6，7，8，9，10 μL，以峰面積（A×10-6）為縱坐標，炔雌醇質(zhì)量濃度（μg·mL-1）為橫坐標進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得線(xiàn)性回歸方程：A=0.4026 C-0.4240， r=0.999 7， 結果表明炔雌醇的質(zhì)量濃度在2～20 μg·mL-1范圍內線(xiàn)性關(guān)系良好。
2.5 精密度試驗
取炔雌醇對照品溶液50 μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，連續進(jìn)樣6次，測定炔雌醇的峰面積，計算其RSD值為0.75%，表明該法精密度良好。
2.6 穩定性試驗
取室溫下保存的質(zhì)量濃度為40 μg·mL-1的對照品溶液于0，6，12，18，24 h分別進(jìn)樣，記錄峰面積，計算其RSD值為1.08%，表明溶液在室溫放置24 h穩定。
2.6 回收率試驗
精密稱(chēng)取炔雌醇對照品2.5 mg置50 mL容量瓶中，甲醇?水（體積比70∶30）溶解并稀釋至刻度，作為對照品儲備液。取計算量的空白脂質(zhì)體（相當10 mg蛋黃卵磷脂）置1～6號50 mL容量瓶中，分別加入1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 mL炔雌醇對照品儲備液，用甲醇?水（體積比70∶30）溶解并稀釋至刻度，分別進(jìn)樣50 μL，在281 nm波長(cháng)處測定峰面積，每個(gè)樣品連續測定5次，代入標準曲線(xiàn)，計算回收率，得平均回收率為100.6%，RSD為1.5%，表明回收率結果良好。
2.7 炔雌醇脂質(zhì)體含量及包封率的測定
分別精密吸取不同配方的炔雌醇脂質(zhì)體各0.2 mL，加流動(dòng)相破乳并稀釋至2.0 mL, 搖勻，作為供試品溶液，取上述溶液各50 μL進(jìn)樣，記錄色譜圖。按外標法計算供試品溶液中炔雌醇的含量及包封率，不同配方的炔雌醇脂質(zhì)體中藥物的含量及包封率結果見(jiàn)表1。表1 炔雌醇脂質(zhì)體中的含量及包封率（略）
3 討 論
3.1 檢測波長(cháng)的選擇
稱(chēng)取炔雌醇原料藥、蛋黃卵磷脂、炔雌醇脂質(zhì)體各適量，加甲醇?水溶解，分別在200～400 nm波長(cháng)范圍內進(jìn)行掃描，結果測得在281 nm處炔雌醇原料藥和炔雌醇脂質(zhì)體都有最大吸收，所以選擇281 nm作為檢測波長(cháng)。
3.2 流動(dòng)相的選擇
最初選擇純甲醇溶解炔雌醇脂質(zhì)體制備樣品溶液，出現大量白色沉淀物，當加入少量純水后，白色沉淀物減少，于是配制不同比例的甲醇?水溶液，當甲醇?水溶液體積比為70∶30時(shí)，炔雌醇脂質(zhì)體溶解澄清。所以采用甲醇?水（體積比70∶30）作為流動(dòng)相，在281 nm波長(cháng)處其他成分無(wú)干擾影響，靈敏度高，準確性好，色譜峰分離優(yōu)良，保留時(shí)間合適。
.3 在脂質(zhì)體的制備過(guò)程中，最后一個(gè)制備步驟是通過(guò)聚碳酸鹽膜擠壓脂質(zhì)體使其達到需求的粒徑，但是隨著(zhù)藥脂比的不斷增大，有一部分藥物在擠壓時(shí)已經(jīng)析出，沉淀在聚碳酸鹽膜上，未進(jìn)入脂質(zhì)體體系，因此在高載藥實(shí)驗中，最終含藥量要少于起始加入量。
.4 比較了不同配方的炔雌醇脂質(zhì)體的包封率。當藥物在脂質(zhì)體中的含量相對適中時(shí)，藥物的包封率非常高，這是由于炔雌醇是脂溶性藥物，在磷脂雙層膜中溶解性能好。但是當制備過(guò)程藥物與磷脂的比例增加到一定值以上，炔雌醇的溶解能力下降，所以能夠包裹進(jìn)脂質(zhì)體中的藥物達到了一定的飽和。這個(gè)分析結果在實(shí)驗中得到了驗證，在制備過(guò)程中觀(guān)察到炔雌醇在擠壓器的濾膜上析出時(shí)，所測得的包封率都較低，藥物析出越多，包封率也越低。
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