消瘤片水提工藝

　　消瘤片水提工藝【1】

　　【摘要】 目的優(yōu)選消瘤片水提工藝。

　　方法以咖啡酸含量、總多糖含量和浸膏得率為指標，采用L9(34)正交設計試驗，　對加水倍量、提取時(shí)間、提取次數等因素進(jìn)行考察，以確定最優(yōu)提取工藝。

　　結果較優(yōu)工藝為加水14倍量，回流提取3次，每次1 h。

　　結論優(yōu)選得到的消瘤片水提工藝穩定、可行。

　　【關(guān)鍵詞】 咖啡酸; 總多糖; 單因素實(shí)驗; 正交試驗

　　消瘤片為新疆醫科大學(xué)附屬中醫醫院婦科長(cháng)期臨床實(shí)踐的經(jīng)驗方,其主要功效為活血化瘀、攻堅消瘤。

　　為方便患者使用，本課題組擬采用先進(jìn)的技術(shù)和工藝，將其制成片劑-消瘤片。

　　根據各味藥材的主要有效成分和理化性質(zhì)，對方中蒲公英、茯苓等7味藥用水提取，其中咖啡酸為蒲公英的主要有效成分，茯苓等藥材主要含有多糖類(lèi)成分。

　　因此，本研究以咖啡酸、多糖為主要評價(jià)指標，采用單因素及正交試驗設計優(yōu)選其水提工藝，現報道如下。

　　1儀器與試藥

　　1.1儀器Waters 2695高效液相色譜儀(美國Waters公司),Cintra20紫外可見(jiàn)分光光度計(GBC科技儀器有限公司),AL204電子天平、AG135電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]，SK3300LH超聲清洗器(上�？茖С�聲儀器有限公司)，Direct QTM5超純水儀(Millipore Corporation, Bedford, MA, U.S.A.)。

　　1.2試藥咖啡酸對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：110885-200102，供含量測定用)，葡萄糖對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：110833-200503，供含量測定用)，甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水，試驗中其它試劑均為分析純。

　　茯苓、蒲公英等7味藥材由新疆醫科大學(xué)附屬中醫醫院提供，經(jīng)檢驗均符合《中國藥典》2010年版一部項下規定。

　　2方法與結果

　　2.1HPLC法測定咖啡酸含量

　　2.1.1色譜條件色譜柱 SYMMETRY C18(4.6 mm×150 mm, 5 μm)，流動(dòng)相為甲醇-乙腈-0.4%磷酸(22∶2∶76)，檢測波長(cháng)323 nm，柱溫30℃，流速1.0 ml/min，進(jìn)樣量15 μl。

　　2.1.2對照品溶液的制備精密稱(chēng)取咖啡酸對照品3.30 mg，加甲醇適量溶解并定容至 10 ml量瓶中,定容至刻度，搖勻。

　　精密吸取1 ml置10 ml量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻。

　　再精密吸取2 ml置25 ml量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻,作為貯備液。

　　2.1.3供試品溶液的制備及測定稱(chēng)取該處方各味藥材適量，加一定量水回流提取一定時(shí)間，待藥液冷卻至室溫后濾過(guò)，精密移取4 ml置10 ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，離心，取上清液經(jīng)微孔濾膜(0.45 μm)過(guò)濾后，取15 μl注入高效液相色譜儀測定，供試品溶液高效液相色譜圖見(jiàn)圖1。

　　圖1供試品溶液高效液相色譜圖

　　2.1.4標準曲線(xiàn)的繪制分別精密吸取貯備液1、2、3、4、5 ml，置于5 ml量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，即得標準溶液。

　　取上述5個(gè)標準溶液，分別用微孔濾膜(0.45 μm)過(guò)濾后，各取15 μl注入高效液相色譜儀測定。

　　以峰面積積分值(Y)為縱坐標，對照品濃度(X)為橫坐標進(jìn)行回歸，得回歸方程為：Y =79 202 X-8 895.9,相關(guān)系數r=0.999 2。

　　結果顯示咖啡酸在0.528～2.64 μg/ml范圍內呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

　　對照品溶液高效液相色譜圖見(jiàn)圖2。

　　圖2對照品溶液高效液相色譜圖

　　2.1.5日內、日間精密度試驗取同一對照品溶液15 μl在同一天內重復進(jìn)樣5次，并連續測定5 d，計算日內及日間精密度。

　　結果日內精密度RSD=0.78%，日間精密度RSD=1.64%，表明本方法精密度良好。

　　2.1.6穩定性試驗取同一供試品溶液15 μl，按0、2、4、6、12、24、48 h 間隔進(jìn)樣。

　　測得咖啡酸的峰面積RSD=0.83%，表明供試品溶液在室溫下放置48 h內穩定。

　　2.1.7重復性試驗取供試品6份，按2.1.3項下方法制備供試液，分別精密吸取15 μl進(jìn)樣，測定峰面積。

　　結果RSD=1.73%。

　　表明該方法重復性良好。

　　2.1.8加樣回收率試驗 取2.1.3項下一定量經(jīng)測定已知含量的供試品溶液，加入不同量的咖啡酸對照品溶液，制備成　高、中、低濃度的各3份樣品，按2.1.1項下色譜條件進(jìn)行含量測定。

　　結果平均加樣回收率為100.34%，RSD=1.17%(n=9)。

　　2.1.9陰性對照試驗精密稱(chēng)取處方中水提部分除蒲公英外的6味藥材，按照2.1.3項下的方法制備缺蒲公英的陰性對照　溶液。

　　用高效液相色譜法測定，進(jìn)樣量15 μl。

　　結果表明，消瘤片處方中水提部分中其余藥材對咖啡酸的含量測定無(wú)干擾。

　　陰性對照溶液高效液相色譜圖見(jiàn)圖3。

　　圖3陰性對照溶液高效液相色譜圖

　　2.2紫外可見(jiàn)分光光度法測定總多糖含量

　　2.2.1對照品溶液的制備 精密稱(chēng)取105℃干燥至恒重的葡萄糖標準品11.32 mg至10 ml量瓶中，加水定容至刻度，搖　勻。

　　再取2.5 ml置25 ml量瓶中，加水定容至刻度搖勻，得濃度為 0.113 2 mg/ml 的葡萄糖標準品儲備液。

　　2.2.2供試品溶液的制備方法稱(chēng)取處方中水提藥材，加適量水加熱回流一定時(shí)間，精密移取濾液1 ml置100 ml量瓶中，定容至刻度，即得。

　　2.2.3最大吸收波長(cháng)的測定精密吸取葡萄糖標準品儲備液和2.2.2項下樣品溶液各0.4 ml于10 ml具塞試管中，加水至2　　ml，分別加入1 ml 5%苯酚溶液和5 ml濃硫酸，迅速搖勻，放置5 min，置沸水浴中加熱20 min，取出迅速冷卻至室溫。

　　另取2.0 ml蒸餾水同前加入試劑操作，作空白對照，在400～800 nm波長(cháng)處掃描。

　　結果顯示葡萄糖對照品溶液和供試品溶液經(jīng)顯色后均在487 nm處有最大吸收。

　　2.2.4標準曲線(xiàn)的制備精密吸取葡萄糖標準品儲備液各0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 ml于10 ml具塞試管中，同2.2.3項下操作，測定吸收值。

　　以吸光度(Y)對葡萄糖濃度(X)進(jìn)行回歸分析，得標準曲線(xiàn)：Y=0.011 1 X-0.015，r=0.9955，表明葡萄糖濃度在22.64～67.92 μg/ml范圍內呈現良好的線(xiàn)形關(guān)系。

　　2.2.5精密度試驗同時(shí)精密吸取2.2.2項下供試品溶液2 ml、標準品儲備液 0.4 ml，照2.2.3項下操作，連續測定5次吸收值。

　　結果供試品及標準品RSD分別為0.11%、0.16%，表明本方法精密度良好。

　　2.2.6穩定性試驗精密吸取2.2.2項下供試品溶液2 ml，照2.2.3項下操作，顯色后放置30、45、60、85、100、125、150、180、240 min時(shí)分別測定吸光度。

　　對4 h內顯色穩定性進(jìn)行了考察。

　　測定結果RSD=1.98%，表明供試品溶液顯色后在4 h內吸光度穩定。

　　2.2.7重復性試驗精密吸取2.2.2項下供試品溶液2 ml，共6份，測定吸收值。

　　結果RSD=2.49%，表明該法重復性良好。

　　2.2.8加樣回收率試驗取2.2.2項下經(jīng)測定已知含量的供試品溶液0.3 ml，加入不同量的葡萄糖標準品溶液，制備成高、中、低濃度的各3份樣品，按2.2.3項下操作，測定吸光度。

　　結果平均加樣回收率為100.44%，RSD=2.61%(n=9)。

　　2.3提取工藝篩選[1-3]

　　2.3.1因素水平的確定以咖啡酸含量、總多糖含量及水提液的浸膏得率為考察指標，采用綜合評分法，權重系數分別　為50、30、20，滿(mǎn)分為100。

　　綜合評分=(咖啡酸含量/最大咖啡酸含量)×50+(多糖含量/ 最大多糖含量)×30+(最小浸膏得率/浸膏得率)×20根據單因素實(shí)驗結果，選擇L9(34)正交表，進(jìn)行正交試驗設計，具體見(jiàn)表1。

　　表1因素水平表

　　2.3.2正交試驗精密稱(chēng)取消瘤片處方中用水提取的藥材，按以下正交試驗表安排實(shí)驗(每個(gè)實(shí)驗同時(shí)做3個(gè)平行樣)，分別測定咖啡酸含量、總多糖含量、浸膏得率，并進(jìn)行綜合評分。

　　直觀(guān)分析結果可知，RC>RB>RA，即對提取影響大小順序為C>B>A，最佳提取工藝為A3B3C3，見(jiàn)表2。

　　表2正交試驗結果

　　2.3.3方差分析結果 對正交試驗結果進(jìn)行方差分析，結果表明，提取次數對該方的提取效果有顯著(zhù)性影響(P<0.05)，提取時(shí)間和加水倍數對提取效果均無(wú)顯著(zhù)性影響。

　　結合工業(yè)大生產(chǎn)，從節約成本的角度考慮，確定較優(yōu)提取工藝為A1B1C3，即14倍量水，回流提取3次，每次1 h，見(jiàn)表3。

　　表3方差分析

　　2.3.4驗證試驗精密稱(chēng)取處方中用水提取的藥材3份，按A1B1C3回流提取得樣品溶液，分別測定咖啡酸含量、總多糖含　　量、浸膏得率，并計算綜合評分(表4)。

　　結果表明，本試驗確定的消瘤片水提工藝穩定、可行、合理。

　　表4正交試驗驗證結果

　　3結論

　　3.1測定咖啡酸含量時(shí)，在確定供試品溶液的HPLC色譜條件時(shí)，考察了藥典方法[4]、甲醇-水、甲醇-磷酸水、乙腈-磷酸水等，結果樣品峰與雜質(zhì)峰未能有效分離。

　　經(jīng)反復試驗，在流動(dòng)相為甲醇-乙腈-0.4%磷酸(22∶2∶76)時(shí)，咖啡酸峰與其他組分色譜峰能較好地分離，空白對照亦無(wú)干擾，且峰形較好。

　　經(jīng)方法學(xué)研究結果表明，本方法簡(jiǎn)便、準確、重復性好，可作為本方水提工藝中咖啡酸的含量測定用。

　　3.2咖啡酸、多糖為本方的主要有效成分，根據它們對療效的影響程度，確定咖啡酸權重系數為50，多糖權重系數為　30，并確定浸膏得率權重系數為20，滿(mǎn)分為100。

　　3.3本試驗采用單因素試驗及正交設計試驗，經(jīng)驗證試驗最終確定14倍量水，回流提取3次，每次1 h的方法為最優(yōu)工　　藝。

　　優(yōu)選得到的消瘤片水提工藝簡(jiǎn)易、穩定、可行，為工業(yè)化生產(chǎn)提供了一定的依據。

　　【參考文獻】

　　[1]譚紅勝,夏興華,楚生輝.正交試驗法優(yōu)選蒲公英水提工藝[J].中藥材,2004,27(3):211-212.

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　　[3]張西如,姜建國.正交試驗研究蒲公英注射液的提取工藝[J].中成藥,2007,29(7):1075-1077.

　　[4]中華人民共和國藥典委員會(huì ).中華人民共和國藥典[S].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010:331.

　　宮瘤消片提取工藝【2】

　　[摘要] 目的：確定宮瘤消片最佳水提取工藝,為該制劑開(kāi)發(fā)成中藥新藥提供依據。

　　方法：以芍藥苷的提取量和浸膏得率作為評價(jià)指標，采用正交試驗優(yōu)選仙鶴草、牡蠣、土鱉子、黨參、白術(shù)、吳茱萸、白花蛇舌草水提方法。

　　結果：取其白花蛇舌草等七味加水煎煮2次，第1次加12倍量水，煎煮1.5 h;第2次加10倍量水，煎煮1 h。

　　結論：本法經(jīng)濟、合理、可行。

　　[關(guān)鍵詞] 宮瘤消片;芍藥苷;提取方法;正交試驗

　　子宮肌瘤是女性生殖器官最常見(jiàn)的良性腫瘤，由平滑肌和結締組織組成，故又稱(chēng)子宮平滑肌瘤。

　　常見(jiàn)于30～50歲婦女，40～50歲為高峰年齡組，20歲以下少見(jiàn)。

　　目前對于子宮肌瘤的治療方法，仍以子宮切除術(shù)占首位。

　　因此，對于未婚、未育及希望保留正常月經(jīng)功能者，具有抗感染作用的口腔藥物的研制一直受到人們的廣泛重視。

　　宮瘤消片是以牡丹皮、香附(制)、三棱、莪術(shù)、仙鶴草、牡蠣、土鱉子、黨參、白術(shù)、吳茱萸、白花蛇舌草經(jīng)提取制成的中藥制劑。

　　本文以芍藥苷的含量和浸膏得率為指標，采用正交試驗法優(yōu)選宮瘤消片的最佳水提方法，為該制劑開(kāi)發(fā)成中藥新藥提供實(shí)驗依據[1-2]。

　　1 儀器與試藥

　　1.1 儀器

　　Agilent 1100型高效液相色譜儀(美國)：Agilent 1100泵、Agilent 1100 DAD檢測器、Agilent 1100色譜工作站;Sartorius BP211D電子天平(感量0.l mg、0.0l mg);USC-502超聲波清洗器。

　　1.2試藥

　　芍藥苷對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：110736-200526);宮瘤消片(自制)，甲醇(色譜純，天津市四有生物醫學(xué)技術(shù)有限公司)，乙腈(色譜純，天津市四有生物醫學(xué)技術(shù)有限公司)，其他試劑均為分析純。

　　2 方法與結果

　　2.1 方法學(xué)考察

　　2.1.1 色譜條件

　　試驗參照國家食品藥品監督管理局宮瘤消膠囊標準，用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;乙腈-0.1% 磷酸溶液(15∶85)為流動(dòng)相;檢測波長(cháng)：230 nm。

　　流速：1.0 ml/min，柱溫：30℃，以Agilent-C18柱(4.6 mm×200 mm，5 μm)為分析柱，進(jìn)行試驗研究，結果芍藥苷與樣品中其他組分色譜峰可基線(xiàn)分離，芍藥苷與其相鄰色譜的分離度大于1.5;按芍藥苷峰計算，理論板數按芍藥苷峰計算應不低于2 000。

　　2.1.2 對照品溶液的制備

　　取芍藥苷對照品適量，用甲醇溶解并制成每毫升含0.1 mg的溶液，即得。

　　2.1.3 供試品溶液的制備

　　取本品10片，研細，取1.163 9 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇20 ml，密塞，稱(chēng)定重量，超聲處理20 min，放冷，再稱(chēng)定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續濾液，即得。

　　2.1.4 線(xiàn)性關(guān)系考察

　　分別精密吸取對照品溶液2、4、6、8、10 μl，按正文色譜條件進(jìn)行分析，測定峰面積，結果見(jiàn)表1。

　　以對照品進(jìn)樣量(μg)為橫坐標，峰面積為縱坐標，計算回歸方程，結果表明芍藥苷進(jìn)樣量在0.2～1.0 μg范圍內，呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

　　回歸方程為Y=1 050.2X+44.93(r=0.999 2)，見(jiàn)圖1。

　　表 1 標準曲線(xiàn)測定結果

　　Tab.1 The result of standardized curve

　　圖1 標準曲線(xiàn)

　　Fig.1 Standardized curve

　　2.1.5 精密度試驗

　　取本品(批號：050601)20片，研細，稱(chēng)取粉末1.163 g，精密稱(chēng)定，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，分別精密吸取10 μl，連續進(jìn)樣5次，供試品峰面積平均值為336.88，RSD=1.42%，結果表明精密度良好。

　　2.1.6 重復性試驗

　　取本品(批號：050601)20片，研細，稱(chēng)取5份，各1.163 g，精密稱(chēng)定，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，測定色譜峰面積，含量平均值為0.486 7 mg/g，RSD=1.29%，結果表明重復性良好。

　　2.1.7 穩定性試驗

　　取本品(批號：050601)20片，研細，稱(chēng)取粉末1.163 g，精密稱(chēng)定，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，分別在制備樣品后的0、2、4、8，12 h進(jìn)樣測定，測得芍藥苷峰面積的平均值為330.46，RSD=1.21%，結果表明供試品溶液在12 h內穩定。

　　2.1.8 回收率試驗

　　精密稱(chēng)取已知含量的樣品(批號：050601，含量：0.553 8 mg/g)5份，分別精密加入對照品溶液1 ml，濃度為0.1 mg/ml，按上述條件依法測定。

　　本法平均回收率為99.26%，RSD=1.65%，表明回收率的重現性較好。

　　結果見(jiàn)表2。

　　2.1.9 樣品含量測定

　　按上述芍藥苷測定方法對十批中試及試生產(chǎn)成品的芍藥苷含量進(jìn)行了測定，每批平行測定2次，結果見(jiàn)表3。

　　表 3 樣品含量測定結果

　　Tab.3 Content determination results of samples

　　2.2 提取方法的篩選

　　2.2.1 因素水平的確定

　　以芍藥苷含量和出膏率為指標，重點(diǎn)考察提取溶媒的用量、提取次數和提取時(shí)間3個(gè)因素，每個(gè)因素選擇3個(gè)水平，按L9(34)正交表設計試驗。

　　因素水平見(jiàn)表4。

　　表 4 因素水平表

　　Tab.4 Factors level table

　　2.2.2考察指標的測定

　　2.2.2.1 芍藥苷的含量測定精密量取樣品液2 ml，置具塞錐形瓶中，加甲醇20 ml，按上述方法測定。

　　2.2.2.2 出膏率的測定精密量取樣品液20 ml，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，蒸干，照干燥失重法(《中國藥典》2005年版一部附錄Ⅸ G)測定。

　　2.2.3正交試驗設計及方差分析

　　見(jiàn)表5～8。

　　2.2.4小結

　　上述方差分析結果表明，以芍藥苷提取量為考察指標，因素A無(wú)顯著(zhù)性差異(P>0.10)，因素B無(wú)顯著(zhù)性差異(P>0.10)，因素C有顯著(zhù)性差異(P<0.05)，根據直觀(guān)分析結果，最佳水提取工藝為A3B3C3。

　　以出膏率為考察指標，因素A無(wú)顯著(zhù)性差異(P>0.10)，因素B無(wú)顯著(zhù)性差異(P>0.10)，因素C有顯著(zhù)性差異(P<0.05)，根據直觀(guān)分析結果，最佳水提取工藝為A3B3C3。

　　綜合上述兩方面結果，最佳水提取工藝為A3B3C3，即本品的最佳提取工藝為：取其白花蛇舌草等七味加水煎煮2次，第1次加12倍量水，煎煮1.5 h;第2次加10倍量水，煎煮1 h。

　　2.2.5 提取工藝驗證

　　根據宮瘤消片提取工藝優(yōu)選結果，連續投料三批，三批結果平行，說(shuō)明提取工藝條件基本穩定。

　　結果見(jiàn)表9。

　　表 9 驗證工藝

　　Tab.9 validation technology

　　3 討論

　　本實(shí)驗室對宮瘤消片中芍藥苷的水提取方法進(jìn)行了研究，實(shí)驗中采用正交試驗法，分別考察了加水量、提取時(shí)間、提取次數對芍藥苷提取率和浸膏得率的影響。

　　浸膏是片劑中也是其他提取液中藥物發(fā)揮療效的物質(zhì)基礎，用它來(lái)比較提取工藝的優(yōu)劣，雖然直觀(guān)簡(jiǎn)便，但是雜質(zhì)的浸出也會(huì )影響浸膏得率，而且并不能標志有效成分的量，故還選擇了芍藥苷作為考察指標，因為此藥材中的芍藥苷是抗菌的有效成分，對多種致病菌有較強的抑制和殺滅作用。

　　試驗中發(fā)現，藥材加熱時(shí)間不宜過(guò)長(cháng)，且要減壓干燥。

　　最后得出提取的優(yōu)選條件為A3B3C3，即藥材用水提取2次，第1次加12倍量水，煎煮1.5 h;第2次加10倍量水，煎煮1 h。

　　提取工藝是現代制備工藝的關(guān)鍵和重點(diǎn)，而采用正交試驗優(yōu)選提取工藝時(shí)，評價(jià)標準的選定，即用什么指標才能真正評價(jià)出工藝的優(yōu)劣又是難點(diǎn)。

　　在本實(shí)驗中，采用浸膏得率、芍藥苷含量2個(gè)指標進(jìn)行評價(jià)，全面且具有代表性，較能客觀(guān)內在地反映提取工藝的優(yōu)劣。

　　[參考文獻]

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　　活血通痹片水提醇沉工藝【3】

　　摘要　目的：篩選并優(yōu)化活血通痹片提取醇沉工藝。

　　方法：以干膏得率和提取物中芍藥苷含量為考察指標，采用正交設計多指標綜合評分法優(yōu)化提取工藝。

　　單因素考察不同醇沉濃度對芍藥苷保留率的影響。

　　結果：通過(guò)正交試驗優(yōu)化確定的提取條件為：藥材飲片第一次以10倍水，第二次8倍，提取2次，每次90min。

　　醇沉濃度為70%。

　　結論：該制備工藝合理，有效成分保留率高。

　　關(guān)鍵詞　芍藥苷

　　活血通痹片是廣東第二中醫院院內制劑，由桃仁、紅花、赤芍等十三味藥組成，具有補腎、活血化瘀、除濕通絡(luò )等功效，主治腎虛血瘀所致腰膝疼痛，腰肌勞損，肢節屈伸不利等病癥。

　　赤芍為毛茛科植物芍藥Paceonia lacti flora Pall.的干燥根。

　　赤芍作為本方臣藥，具清熱涼血，散瘀止痛之功效。

　　因此，將赤芍中芍藥苷含量作為指標性成分，結合提取工藝浸膏得率為考察指標，采用正交試驗設計對其提取條件優(yōu)選，采用單因素考察法對醇沉工藝進(jìn)行優(yōu)化，為生產(chǎn)工藝參數的確定提供依據。

　　1　儀器與試藥

　　Agilent 1200高效液相色譜儀：G1316A檢測器、G1312A二元泵、G1329A柱溫箱、G2170A數據處理系統(Agilent，美國);XS2055分析天平(梅特勒，瑞士)，藥材飲片(廣州致信藥業(yè)有限公司，批號20100206)，芍藥苷對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：110736-200901)，水為超純水，甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。

　　2　方法與結果

　　2，1　干膏得率的測定方法　取各正交實(shí)驗號濃縮液10ml于干燥蒸發(fā)皿中水浴蒸干，照干燥失重測定法(中國藥典2010年版一部附錄IXG)測定，計算干膏得率。

　　2，2　芍藥苷含量測定

　　2，2，1　對照品制備：利用分析天平精密稱(chēng)取已干燥的芍藥苷對照品5.12mg，置于50ml容量瓶，甲醇溶解定容至50ml，即芍藥苷為0.1024mg/ml。

　　2，2，2　樣品制備及測定：取各正交實(shí)驗號濃縮液5ml，置干燥蒸發(fā)皿中80℃水浴蒸干，甲醇溶解定容至50ml。

　　同法制備陰性樣品。

　　2，2，3　色譜條件：色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18柱(4.6×150mm，5μm);流動(dòng)相：甲醇：0.1%磷酸水(14：86);檢測波長(cháng)230nm，柱溫25℃。

　　將芍藥苷對照品分別進(jìn)樣，2、3、4、6、8、10μl，由圖1芍藥苷在該色譜條件下峰形良好，其中芍藥苷在204.8～1024ng范圍內線(xiàn)性關(guān)系良好，回歸方程為：峰面積Y=1.57942389X-2.6122678，r=0.99995(見(jiàn)圖2)將陰性樣品和待測樣品進(jìn)樣檢測，結果表明，陰性樣品色譜在芍藥苷相應的保留時(shí)間上無(wú)色譜峰(見(jiàn)圖3)，樣品中芍藥苷色譜峰分離度良好(圖4)。

　　2，2　吸水率考察　按處方稱(chēng)取的藥材，加10倍量的水浸泡，每隔1個(gè)小時(shí)觀(guān)察一次浸透心情況，直至藥材全部浸透，濾過(guò)，量取濾液體積，計算藥材吸水率，求得藥材吸水率為192.3%。

　　2，3　正交設計優(yōu)選提工藝　活血通痹片采用水煎煮提取工藝，在單因素試驗考察的基礎上，采用正交試驗優(yōu)化提取工藝，選取加水量(A)，提取次數(B)，提取時(shí)間(c)，作為考察因素，各取三水平，進(jìn)行L9(34)正交試驗，篩選最佳工藝條件，因素水平表見(jiàn)表1。

　　赤芍作為方中臣藥，芍藥苷為其主要成分，本試驗以高效液相法測定提取液中芍藥苷的含量，作為評價(jià)指標之一，權重系數定為0.6;而作為有效成分煎出間接控制的一個(gè)指標，藥效物質(zhì)提取的多少以干膏得率為考察指標，權重系數定為0.4，以?xún)芍笜说慕Y果進(jìn)行綜合評分。

　　試驗時(shí)按處方量稱(chēng)取藥材、飲片，按正交試驗設計各實(shí)驗號進(jìn)行提取，濾過(guò)，濾液減壓濃縮，定容至200ml，備用。

　　分別按2.2項下方法測定干膏得率、芍藥苷含量，采用以下公式：

　　Y=(40/得膏率max)×得膏率+(60/(芍藥苷含量)max)×(芍藥苷)含量

　　進(jìn)行綜合評分，用SPSS11.0統計軟件進(jìn)行數據處理，對評分結果作直觀(guān)分析和方差分析，以判斷各因素對提取效果的影響程度，篩選出在該試驗條件下最優(yōu)的提取條件，試驗安排及結果見(jiàn)表2，方差分析結果見(jiàn)表3。

　　由直觀(guān)分析可知，影響提取工藝效果的因素順序為：提取時(shí)間(B)>提取次數(c)>加水量(A)，最佳工藝組合為A283C2。

　　方差分析結果顯示，提取次數和提取時(shí)間均對提取結果具有顯著(zhù)性影響，而加水量對試驗結果的影響無(wú)顯著(zhù)性影響。

　　由于處方藥材吸水率為192.3%，綜合考慮縮短生產(chǎn)周期，降低生產(chǎn)成本等綜合因素，選擇第一次加水10倍量，第二次加水8倍，提取2次，每次提取90min作為水提取工藝參數。

　　2，4　驗證實(shí)驗　為確定該工藝條件的穩定性，以篩選的最佳條件，驗證3批，結果見(jiàn)表4。

　　驗證試驗結果與正交試驗優(yōu)選結果吻合，表明正交試驗優(yōu)選確定的工藝條件合理、穩定、可行。

　　2，5　醇沉工藝優(yōu)選　中藥提取液一般體積較大，一般需進(jìn)一步分離和精制。

　　藥材的水提取藥液常用醇沉方法，以除去雜質(zhì)，從而達到減少服用量，提高藥物穩定性的目的。

　　考慮本活血通痹復方制劑最后制備成片劑，載藥量小，所以對所得中藥提取液進(jìn)行醇沉精制，除去蛋白質(zhì)、鞣質(zhì)等雜質(zhì)，進(jìn)一步增大載藥量。

　　由于不同醇沉濃度除雜效果和有效成分保留率不一，故采用單因素考察法，以芍藥苷保留率為指標，考察不同醇沉濃度對醇沉效果的影響。

　　芍藥苷保留率計算方法如下：

　　芍藥苷保留率(%)=醇沉前芍藥苷含量/醇沉后上清液芍藥苷含量×100%

　　按處方比例稱(chēng)取藥材4份，根據提取工藝試驗結果，第一次加水10倍，第二次加水8倍，提取2次，各1.5h。

　　提取完成后濃縮定容至200ml(相對密度1.08～1.10)，分別按下表加入乙醇至相應醇沉濃度，醇沉靜置過(guò)夜24h，取上清液，回收乙醇，濃縮定容至200ml，按2.2項下測定芍藥苷含量。

　　由表5可知，當隨著(zhù)醇沉乙醇濃度的加大，芍藥苷保留率不斷提高，醇沉濃度為70%時(shí)，芍藥苷保留率可達95%以上，因此，確定活血通痹片的醇沉工藝為濃縮至相對密度1.08～1.10后，加乙醇至70%醇沉，靜置過(guò)夜，取上清液，回收乙醇，濃縮，即得。

　　3　討論

　　中藥復方提取效果直接關(guān)系到產(chǎn)品的質(zhì)量和療效，選擇評價(jià)提取工藝優(yōu)劣的評價(jià)指標是研究工作中的重要問(wèn)題，合理的提取工藝評價(jià)指標應該是提取的有效成分質(zhì)和量的代表，也是提取物臨床作用性質(zhì)和強度的代表。

　　本文選取了方中臣藥芍藥中主要成分芍藥苷的含量以及得膏率二者綜合評分作為考察指標，確定提取工藝為第一次加水10倍，第二次加水8倍，提取2次，各1.5h。

　　確定醇沉工藝為提取完成后，濃縮至含生藥1g/ml(相對密度1.08～1.10)，加乙醇至含醇量為70%，芍藥苷保留率可達95%以上。

　　活血通痹片是在依據傳統中醫理論，結合目前藥理研究的基礎上化裁而來(lái)。

　　為了使其復合功效得到良好發(fā)揮，根據處方所含有效成分，在制定制備工藝路線(xiàn)時(shí)采取分步考察，以期達到對本方中脂溶性和水溶性有效成分最大限度的提取目的。

　　本實(shí)驗對水提醇沉工藝進(jìn)行了初步探討，其他部分有待于進(jìn)一步完善報道。

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