蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析
論文摘要：隨著(zhù)科學(xué)的不斷發(fā)展，運用質(zhì)譜法進(jìn)行蛋白質(zhì)的分析日益增多，本文簡(jiǎn)要綜述了肽和蛋白質(zhì)等生物大分子質(zhì)譜分析的特點(diǎn)、方法及蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析的原理、方式和應用，并對其發(fā)展前景作出展望。
論文關(guān)鍵詞：蛋白質(zhì) 質(zhì)譜分析 應用
0 引言
蛋白質(zhì)是生物體中含量最高，功能最重要的生物大分子，存在于所有生物細胞，約占細胞干質(zhì)量的50%以上，作為生命的物質(zhì)基礎之一，蛋白質(zhì)在催化生命體內各種反應進(jìn)行、調節代謝、抵御外來(lái)物質(zhì)入侵及控制遺傳信息等方面都起著(zhù)至關(guān)重要的作用，因此蛋白質(zhì)也是生命科學(xué)中極為重要的研究對象。
1 質(zhì)譜分析的特點(diǎn)
質(zhì)譜分析用于蛋白質(zhì)等生物活性分子的研究具有如下優(yōu)點(diǎn)：很高的靈敏度能為亞微克級試樣提供信息，能最有效地與色譜聯(lián)用，適用于復雜體系中痕量物質(zhì)的鑒定或結構測定，同時(shí)具有準確性、易操作性、快速性及很好的普適性。
2 質(zhì)譜分析的方法
近年來(lái)涌現出較成功地用于生物大分子質(zhì)譜分析的軟電離技術(shù)主要有下列幾種：①電噴霧電離質(zhì)譜;②基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜;③快原子轟擊質(zhì)譜;④離子噴霧電離質(zhì)譜;⑤大氣壓電離質(zhì)譜。在這些軟電離技術(shù)中，以前面三種近年來(lái)研究得最多，應用得也最廣泛。
3 蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析
蛋自質(zhì)是一條或多條肽鏈以特殊方式組合的生物大分子，復雜結構主要包括以肽鏈為基礎的肽鏈線(xiàn)型序列[稱(chēng)為一級結構]及由肽鏈卷曲折疊而形成三維[稱(chēng)為二級，三級或四級]結構。目前質(zhì)譜主要測定蛋自質(zhì)一級結構包括分子量、肽鏈氨基酸排序及多肽或二硫鍵數目和位置。
3.1 蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析原理 以往質(zhì)譜(MS)僅用于小分子揮發(fā)物質(zhì)的分析，由于新的離子化技術(shù)的出現，如介質(zhì)輔助的激光解析/離子化、電噴霧離子化，各種新的質(zhì)譜技術(shù)開(kāi)始用于生物大分子的分析。其原理是：通過(guò)電離源將蛋白質(zhì)分子轉化為氣相離子，然后利用質(zhì)譜分析儀的電場(chǎng)、磁場(chǎng)將具有特定質(zhì)量與電荷比值(M/Z值)的蛋白質(zhì)離子分離開(kāi)來(lái)，經(jīng)過(guò)離子檢測器收集分離的離子，確定離子的M/Z值，分析鑒定未知蛋白質(zhì)。
3.2 蛋白質(zhì)和肽的序列分析 現代研究結果發(fā)現越來(lái)越多的小肽同蛋白質(zhì)一樣具有生物功能，建立具有特殊、高效的生物功能肽的肽庫是現在的研究熱點(diǎn)之一。因此需要高效率、高靈敏度的肽和蛋白質(zhì)序列測定方法支持這些研究的進(jìn)行�，F有的肽和蛋白質(zhì)測序方法包括N末端序列測定的化學(xué)方法Edman法、C末端酶解方法、C末端化學(xué)降解法等，這些方法都存在一些缺陷。例如作為肽和蛋白質(zhì)序列測定標準方法的N末端氨基酸苯異硫氰酸酯(phenylisothiocyanate)PITC分析法(即Edman法，又稱(chēng)PTH法)，測序速度較慢(50個(gè)氨基酸殘基/天);樣品用量較大(nmol級或幾十pmol級);對樣品純度要求很高;對于修飾氨基酸殘基往往會(huì )錯誤識別，而對N末端保護的肽鏈則無(wú)法測序。C末端化學(xué)降解測序法則由于無(wú)法找到PITC這樣理想的化學(xué)探針，其發(fā)展仍面臨著(zhù)很大的困難。在這種背景下，質(zhì)譜由于很高的靈敏度、準確性、易操作性、快速性及很好的普適性而倍受科學(xué)家的廣泛注意。在質(zhì)譜測序中，靈敏度及準確性隨分子量增大有明顯降低，所以肽的序列分析比蛋白容易許多，許多研究也都是以肽作為分析對象進(jìn)行的。近年來(lái)隨著(zhù)電噴霧電離質(zhì)譜(electrospray ionisation，ESI)及基質(zhì)輔助激光解吸質(zhì)譜(matrix assisted laser desorption/ionization，MALDI)等質(zhì)譜軟電離技術(shù)的發(fā)展與完善，極性肽分子的分析成為可能，檢測限下降到fmol級別，可測定分子量范圍則高達100000Da，目前基質(zhì)輔助的激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜法(MALDI TOF MS)已成為測定生物大分子尤其是蛋白質(zhì)、多肽分子量和一級結構的有效工具，也是當今生命科學(xué)領(lǐng)域中重大課題——蛋白質(zhì)組研究所必不可缺的關(guān)鍵技術(shù)之一。目前在歐洲分子生物實(shí)驗室(EMBL)及美國、瑞士等國的一些高校已建立了MALDI TOF MS蛋白質(zhì)一級結構(序列)譜庫，能為解析FAST譜圖提供極大的幫助，并為確證分析結果提供可靠的依據。
3.3 蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析方式 質(zhì)譜用于肽和蛋白質(zhì)的序列測定主要可以分為三種方法：一種方法叫蛋白圖譜(proteinmapping)，即用特異性的酶解或化學(xué)水解的方法將蛋白切成小的片段，然后用質(zhì)譜檢測各產(chǎn)物肽分子量，將所得到的肽譜數據輸入數據庫，搜索與之相對應的已知蛋白，從而獲取待測蛋白序列。將蛋白質(zhì)繪制“肽圖”是一重要測列方法。第二種方法是利用待測分子在電離及飛行過(guò)程中產(chǎn)生的亞穩離子，通過(guò)分析相鄰同組類(lèi)型峰的質(zhì)量差，識別相應的氨基酸殘基，其中亞穩離子碎裂包括“自身”碎裂及外界作用誘導碎裂.第三種方法與Edman法有相似之處，即用化學(xué)探針或酶解使蛋白或肽從N端或C端逐一降解下氨基酸殘基，形成相互間差一個(gè)氨基酸殘基的系列肽，名為梯狀測序(laddersequencing)，經(jīng)質(zhì)譜檢測，由相鄰峰的質(zhì)量差知道相應氨基酸殘基。
3.3.1 蛋白消化 蛋白的基團越大，質(zhì)譜檢測的準確率越低。因此，在質(zhì)譜檢測之前，須將蛋白消化成小分子的多肽，以提高質(zhì)譜檢測的準確率。一般而言，6-20個(gè)氨基酸的多肽最適合質(zhì)譜儀的檢測�，F今最常用的酶為胰蛋白酶(trypsin)，它于蛋白的賴(lài)氨酸(lysine)和精氨酸(arginine)處將其切斷。因此，同一蛋白經(jīng)胰蛋白酶消化后，會(huì )產(chǎn)生相同的多肽。
3.3.2 基質(zhì)輔助激光解吸電離/飛行時(shí)間質(zhì)譜測量法(MALDI-TOF MS) 簡(jiǎn)而言之，基質(zhì)輔助激光解吸電離/飛行時(shí)間質(zhì)譜測量?jì)x是將多肽成分轉換成離子信號，并依據質(zhì)量/電荷之比(mass/charge，m/z)來(lái)對該多肽進(jìn)行分析，以判斷該多肽源自哪一個(gè)蛋白。
3.3.3 電子噴霧電離質(zhì)譜測量法(electrosprayion-izationmassspectrometry，ESI-MS)。
4 蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析的應用
1981年首先采用FAB雙聚焦質(zhì)譜測定肽分子量，分析十一肽(Mr=1318)，質(zhì)譜中出現準分子離子[M+1]+=1319強峰。在蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析中，質(zhì)譜的準確性(accuracy)對測定結果有很大影響，因此質(zhì)譜測序現在仍很難被應用于未知蛋白的序列測定。肽和蛋白的質(zhì)譜序列測定方法具有快速、用量少、易操作等優(yōu)點(diǎn)，這些都非常適合于現在科學(xué)研究的需要。我們相信，隨著(zhù)各種衍生化方法和酶解方法的不斷改進(jìn)，蛋白雙向電泳的應用以及質(zhì)譜技術(shù)的不斷完善，質(zhì)譜將會(huì )成為多肽和蛋白質(zhì)分析最有威力的工具之一。
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