紫杉醇改變FADD在食管鱗癌中的表達

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　　【摘要】 目的 人食管鱗癌細胞株Eca109中Fas相關(guān)死亡結構域蛋白(Fas associated death domain protein, FADD)表達與 紫杉醇的關(guān)系影響分析,紫杉醇在食管鱗癌治療中的作用機制探討。方法 流式細胞術(shù)檢測不同濃度紫杉醇處理下，人食管癌細胞株Eca109細胞凋亡率，同時(shí)采用Western blotting分析細胞中FADD的表達變化。結果 紫杉醇誘導人食管癌細胞株Eca109細胞凋亡呈劑量依賴(lài)性;隨著(zhù)紫杉醇劑量的增加，實(shí)驗組Eca109細胞中FADD表達呈顯著(zhù)增高。結論 一定劑量的紫杉醇可以提高FADD在食管癌細胞中的表達、促進(jìn)食管癌細胞的凋亡，這可能是紫杉醇治療食管癌的分子機制之一。

　　【關(guān)鍵詞】 紫杉醇;食管癌;凋亡;FADD

　　食管癌是常見(jiàn)消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)病隱匿,確診時(shí)大多已屬于中晚期，使很多患者在手術(shù)前后需要接受化學(xué)治療,以確保手術(shù)效果，同時(shí)化療也為很多失去手術(shù)機會(huì )的患者提供了治療的機會(huì )。紫杉醇品名為T(mén)axol，最早是Wall和Wani于1963 年從太平洋紅豆杉的皮中提取得到[1]，經(jīng)過(guò)臨床試驗后近年來(lái)已經(jīng)廣泛應用于臨床包括食管癌在內的多種腫

　　瘤的化療中。紫杉醇可作用于細胞凋亡受體途徑的Fas/FasL 通路或激活凋亡啟動(dòng)途徑的半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶系統(caspases), 誘導細胞凋亡[2,3]，而FADD是Fas/FasL凋亡系統中的必需分子，不僅參與細胞凋亡過(guò)程的發(fā)生，還與細胞周期的調節有關(guān)。研究[4]證實(shí)從食管正常黏膜到不典型增生的組織中，FADD蛋白及mRNA表達呈現顯著(zhù)下降趨勢。已有臨床研究[5,6]表明紫杉醇聯(lián)合順鉑、奈達鉑、氟尿嘧啶等藥物治療食管癌,可以提高其總有效率,且毒副作用無(wú)明顯增加，患者耐受性較好，表明紫杉醇在食管癌治療中具有很高的臨床應用價(jià)值。同時(shí)紫杉醇對人食管癌細胞的生長(cháng)有明顯的抑制作用, 使細胞分裂阻滯于G2-M 期, 并誘導腫瘤細胞凋亡[7]。但現有研究并沒(méi)有對這一過(guò)程中食管癌細胞中FADD的表達變化情況作進(jìn)一步研究。

　　作者通過(guò)檢測不同濃度紫杉醇誘導人食管鱗癌細胞株Ec-109 細胞凋亡,并檢測細胞表達FADD蛋白的變化情況，探討紫杉醇抑制人食管癌細胞增殖、誘導細胞凋亡的分子機制,為臨床應用提供實(shí)驗依據。

　　1 材料和方法

　　1.1 試劑與藥物 泰素(紫杉醇的商品名, 由百時(shí)美施貴寶公司惠供, 6 g/L, 分子質(zhì)量8539 u)，RPMI1640培養液、005%的胰蛋白酶及小牛血清為Hyclone產(chǎn)品, Annexin V(FITC)/PI凋亡檢測試劑盒購于杭州隆基生物工程研究所, 蛋白提取液購于Pierce公司，兔抗人FADD單克隆抗體及鼠抗人β-actin單克隆抗體購于Santa Cruz公司，考馬斯亮藍試劑盒購于南京建成生物科技有限公司。

　　1.2 細胞與細胞培養 人食管癌細胞株Eca-109(ATCC)由上海麥莎生物科技有限公司代購。細胞接種于含10% 小牛血清的RPMI 1640培養液培養, 生長(cháng)于37℃含5% 的CO2孵箱中, 待細胞生長(cháng)至對數生長(cháng)期開(kāi)始實(shí)驗。胰蛋白酶消化細胞后培養基重懸，調整細胞數為5×10.5/ml接種于6孔培養板進(jìn)行培養， 24 h后更換新鮮培養液，同時(shí)實(shí)驗組培養液中分別加入終濃度為 5、10、20、50 nmol/L 泰素，對照組不加藥物，每個(gè)濃度設3個(gè)復孔，培養24 h后收集各組細胞。

　　1.3 凋亡檢測

　　收集每組細胞后PBS洗滌離心，細胞重懸于300 μl Banding buffer中，加入5 μl AnnexinV-FITC混勻，室溫避光孵育15 min，再加入5 μl PI，室溫避光孵育5 min，上流式細胞儀檢測細胞凋亡率，同時(shí)以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作為對照。

　　14 Western blotting 分別收集每組細胞，PBS洗滌離心后，加入含蛋白酶抑制劑的蛋白提取液，提取細胞總蛋白并調整蛋白濃度后100℃煮沸變性。取適量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，半干法轉膜，封閉，按1：1000分別孵育兔抗人FADD單克隆抗體及鼠抗人β-actin單克隆抗體，4℃過(guò)夜后洗膜，按1：1000分別孵育羊抗兔及羊抗鼠二抗，洗膜，化學(xué)發(fā)光底物顯影照相后進(jìn)行圖片分析及數據采集。

　　1.5 統計學(xué)方法

　　以上實(shí)驗均重復3次，實(shí)驗數據采用SPSS 130軟件分析處理，統計學(xué)方法采用t檢驗，組間比較采用單因素方差分析，P<005表示差異有統計學(xué)意義。

　　2 結果

　　21 紫杉醇誘導人食管癌細胞株Eca-109凋亡檢測 實(shí)驗結果顯示，實(shí)驗組細胞凋亡率顯著(zhù)高于對照組，實(shí)驗組中紫杉醇藥物濃度5 nmol/L組與10 nmol/L之間差異無(wú)統計學(xué)意義，藥物濃度升高至20 nmol/L和50 nmol/L后細胞凋亡率顯著(zhù)升高，與5 nmol/L組和10 nmol/L之間差異有統計學(xué)意義，見(jiàn)圖1。

　　22 細胞表達FADD 蛋白水平檢測 檢測結果顯示，所有實(shí)驗組中Eca-109細胞表達FADD蛋白水平較對照組均有升高，見(jiàn)圖2，a。但僅紫杉醇藥物濃度為20 nmol/L組和50 nmol/L組中細胞表達

　　3 討論

　　研究結果顯示，紫杉醇能誘導人食管癌細胞株Eca-109細胞凋亡，當紫杉醇濃度達到20 nmol/L和50 nmol/L時(shí)，細胞凋亡率顯著(zhù)升高。這一研究結果提示，只有紫杉醇達到一定血藥濃度后，才會(huì )對食管癌細胞產(chǎn)生抗癌作用。低濃度紫杉醇作用可能只會(huì )抑制細胞增殖，并不一定能引起食管癌細胞的凋亡。FADD是FAS受體和部分TNF死亡受體家族成員介導信號通路中的胞質(zhì)死亡信號銜接蛋白，其羧基端的死亡結構域DD與Fas分子胞漿段內的DD結合，當Fas與FasL結合導致Fas胞內的死亡域形成三聚體而活化,并引起與之結合的FADD構象改變,使Caspase- 8前體集聚、斷裂和激活,產(chǎn)生有活性的Caspase - 8,從而激發(fā)一系列下游的Caspase - 3 等級聯(lián)反應, 誘發(fā)細胞凋亡[8]。檢測結果顯示，當紫杉醇誘導人食管癌細胞株Eca-109細胞凋亡時(shí)，細胞表達FADD蛋白水平顯著(zhù)升高，而低濃度組之間差異無(wú)統計學(xué)意義。這表明紫杉醇可能通過(guò)Fas/FasL途徑在食管癌治療中起作用，一定劑量的紫杉醇可以誘導食管癌細胞FADD表達水平的升高，促進(jìn)癌細胞凋亡。這也提示在抗腫瘤治療過(guò)程中，紫杉醇的用量也是關(guān)鍵。

　　食管癌的治療是一個(gè)綜合治療的過(guò)程，化療只是所有治療方法中的一種。紫杉醇雖然在食管癌臨床治療中已經(jīng)顯現出一定的價(jià)值，但仍無(wú)法徹底改變食管癌疾病的預后。作者也僅僅選用了食管癌中的鱗癌細胞株作研究，還不能代表食管癌所有病理類(lèi)型，將進(jìn)一步深入研究，以期能為食管癌的治療提供更為有價(jià)值的理論基礎。

　　參 考 文 獻

　　[1] Wani M C, Taylor H L, Wall M E,et al. Am. Chem. Soc, 1971, 93:2325-2327.

　　[2] Ferreira CG, Tolis C,Span SW,et al. The Fas/FasL(CD 95/A PO 1)signaling pathway does not mediate drug-induced apoptosis in lung cancer cells.Clin Cancer Res, 2000,6(1):203-212.

　　[3] Essmann F, Wieder T,Otto A,et al. GDP dissociation inhibitor D4-G DI(Rho-GDI2), but not the homologous Rho-GDI1,is cleaved by caspase-3 during drug-induced apoptosis. Biochem J,2000,346:777-783.

　　[4] 許欣,彭林濤,劉麗華,等.食管上皮癌變過(guò)程中FAS、FASL、FADD和caspase-8的表達及其意義.基礎醫學(xué)與臨床,2007，5(27)：525-529.

　　[5] 張永香.108例晚期食管癌的藥物治療與分析.中國現代藥物應用,2010(14):109-110.

　　[6] 龐東生.紫杉醇聯(lián)合奈達鉑和氟尿嘧啶治療晚期食管癌的臨床觀(guān)察.臨床腫瘤學(xué)雜志,2010,15(2):169-170

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