正常絨毛和葡萄胎中Mel-CAM標記中間型滋養細胞的增殖情況論文

　　目的 探討葡萄胎中Mel-CAM與滋養細胞黏附、浸潤之間的關(guān)系以及Mel-CAM標記中間型滋養細胞(IT)的增殖情況。方法 采用雙重免疫組化法，檢測Mel-CAM標記IT的Ki-67表達情況。結果 葡萄胎中Mel-CAM表達較正常絨毛明顯增高，差異有統計學(xué)意義(P<0.05)；葡萄胎絨毛表面有Mel-CAM標記IT出現，而正常絨毛表面則無(wú)；葡萄胎組織中IT的Ki-67指數較正常絨毛明顯增高，差異有統計學(xué)意義(P<0.05)。結論 葡萄胎絨毛表面有Mel-CAM表達，表現出雙重分化方向，這可能與葡萄胎的發(fā)病機制有關(guān)；檢測葡萄胎組織中IT的Ki-67指數對于預測葡萄胎的轉歸有潛在的價(jià)值。
　　
　　ABSTRACT: Objective  To explore the relationship between Mel-CAM and adherence and invasion of trophoblastic cells and proliferation of Mel-CAM defined intermediate trophoblast. Methods  Double immunohistochemical staining technique was used to detect the expression of Ki-67 in Mel-CAM defined intermediate trophoblast in human villi during the first trimester and hydatidiform mole. Results  In this study there was a significantly stronger expression of Mel-CAM in hydatidiform mole than that in first-trimester villi (P<0.05). The expression of Mel-CAM in hydatidiform mole was observed on the surface of villi, but not in human villi. The Ki-67 index of hydatidiform mole was higher than that it of human villi with a significant difference (P<0.05). Conclusion  Mel-CAM might play an important role in the invasion of trophoblastic cells. The different differentiation type of villous trophoblast in hydatidiform mole and the first-trimester villi may be correlated with pathogenesis. The Ki-67 index of intermediate trophoblast has a potential value in predicting prognosis of hydatidiform mole.
　　
　　KEY WORDS: melanoma cell adhesion molecule; intermediate trophoblast; Ki-67; hydatidiform mole
　　
　　中間型滋養細胞(intermediate trophoblast, IT)是正常胎盤(pán)和妊娠滋養細胞疾病(gestational trophoblastic disease, GTD)中一類(lèi)特殊的滋養細胞類(lèi)型。隨著(zhù)研究的深入，逐漸認識到IT是一類(lèi)獨立的細胞類(lèi)型，有自身特殊的免疫組織化學(xué)和生物學(xué)特征，并且IT的獨立增生可以形成胎盤(pán)部位滋養細胞腫瘤(placental site trophoblastic tumor, PSTT)、超常胎盤(pán)部位(exaggerated placental site, EPS)、胎盤(pán)部位結節(placental site nodule, PSN)和上皮樣滋養細胞腫瘤(epithelioid trophoblastic tumor, ETT)等多種良、惡性疾病。但是，由于IT的細胞形態(tài)學(xué)特征介于合體滋養細胞(syncytiotrophoblast, ST)和細胞滋養細胞(cytotrophoblast, CT)之間，給研究工作帶來(lái)了極大的困難。隨著(zhù)IT的特異性標記物Mel-CAM的發(fā)現，使得IT的研究跨入了一個(gè)新的階段。因此，本研究中利用Mel-CAM標記IT，研究其在正常絨毛和葡萄胎中的增殖情況，以期對IT與疾病的關(guān)系有更進(jìn)一步的了解。
　　
　　1  對象與方法
　　
　　1.1  研究對象
　　
　　選擇1995年1月至2000年12月間西安交通大學(xué)醫學(xué)院第一附屬醫院的葡萄胎(hydatidiform mole, HM)組織標本30例作為研究組，患者年齡22-50歲，平均32歲。選擇2000年門(mén)診正常早期妊娠(6-12周)人流術(shù)后絨毛組織標本20例作為對照組。
　　
　　1.2  主要試劑
　　
　　鼠抗人Mel-CAM及Ki-67單克隆抗體均為北京中山金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。
　　
　　1.3  標本的制備及免疫組化染色
　　
　　取上述葡萄胎患者首次清宮組織標本及正常早期妊娠絨毛組織標本，多聚甲醛固定，石蠟包埋，常規切片，切片厚5 μm。用雙重免疫組化的方法先進(jìn)行Ki-67的染色，DAB顯色；然后做Mel-CAM染色，AEC顯色。陰性對照：用相鄰切片對照染色，以PBS代替第一抗體作為陰性對照。陽(yáng)性對照：用已知陽(yáng)性絨癌組織切片做Me l-CAM的陽(yáng)性對照，乳腺癌組織切片做Ki-67的陽(yáng)性對照。
　　
　　1.4  結果判斷
　　
　�、費el-CAM標記IT的比例。每張切片觀(guān)察10個(gè)高倍視野(×400)，每個(gè)高倍視野計數100個(gè)滋養細胞，計算其中Mel-CAM陽(yáng)性染色細胞所占的比例。陽(yáng)性細胞數<25%為陰性(-)，25%-50%為弱陽(yáng)性(＋)，50%-75%為陽(yáng)性(?)，>75%為強陽(yáng)性(?)。②Ki-67標記指數。每張切片觀(guān)察10個(gè)高倍視野(×400)，每個(gè)高倍視野計數100個(gè)中間型滋養細胞，計算其中Ki-67陽(yáng)性核的IT的百分比。
　　
　　1.5  統計學(xué)方法
　　
　　所有資料采用SPSS13.0軟件分析。資料為等級計數資料，采用Kruskal-Wallis秩和檢驗，雙側P<0.05為有統計學(xué)意義。
　　
　　2  結果
　　
　　2.1  Mel-CAM的表達
　　
　　Mel-CAM表達僅見(jiàn)于IT，表現為均勻一致的線(xiàn)性染色包繞于整個(gè)IT表面。ST和CT無(wú)表達，蛻膜、內膜腺體和基質(zhì)炎癥細胞對Mel-CAM均為陰性表達。IT的Mel-CAM染色不僅表達在單核IT中，多核IT表面也可見(jiàn)表達，展示了一個(gè)IT變化的系列形態(tài)(圖1、圖2)。這可能顯示了從CT向ST轉變的一個(gè)中間階段。無(wú)論在正常絨毛還是葡萄胎組織中，所有的Mel-CAM陽(yáng)性細胞的染色強度無(wú)明顯差異。
　　
　　在正常絨毛表面未見(jiàn)Mel-CAM表達，滋養細胞柱和浸潤蛻膜的部分絨毛外IT中可見(jiàn)染色。這種染色模式在一定程度上反映了細胞滋養細胞在絨毛表面和絨毛外的不同分化途徑，以及不同類(lèi)型滋養細胞的生物學(xué)特點(diǎn)。
　　
　　在葡萄胎組織的Mel-CAM陽(yáng)性染色不僅出現在絨毛外IT，絨毛表面也有滋養細胞的表達(圖1-圖4)。葡萄胎組織中Mel-CAM染色的陽(yáng)性細胞比例較正常絨毛組織染色明顯增加，二者間差異有統計學(xué)意義(P<0.05)。
　　
　　2.2  Ki-67的表達
　　
　　Ki-67蛋白著(zhù)色部位在細胞核中，為棕黃色顆粒狀，顆粒顏色深淺不一，大小各異。CT、IT及蛻膜細胞和部分淋巴細胞的細胞核均可見(jiàn)陽(yáng)性染色，以CT的表達為主，ST中無(wú)表達。在正常絨毛中，僅有絨毛內層的部分CT 表達Ki-67，少數IT可見(jiàn)陽(yáng)性染色，ST均為陰性。葡萄胎中絨毛內層大多數CT均對Ki-67有陽(yáng)性染色，部分浸潤的IT有著(zhù)色，ST無(wú)表達(圖1-圖4)。
　　
　　2.3  Mel-CAM標記IT的增殖
　　
　　正常絨毛中，大部分Mel-CAM標記IT，包括多核IT，不顯示Ki-67染色；而葡萄胎中Mel-CAM標記IT的Ki-67染色明顯增加，絨毛表面和浸潤的IT中均有表達，Ki-67標記指數見(jiàn)表1。與正常絨毛相比，葡萄胎組織中Mel-CAM標記IT的Ki-67標記指數水平較高，二組間差異有統計學(xué)意義(P<0.05)。表1  Ki-67在Mel-CAM標記IT中的表達（略）
　　
　　3  討論
　　
　　黑素瘤細胞黏附分子(melanoma cell adhesion molecule, Mel-CAM)又稱(chēng)CD146或MUC18，是一種單鏈跨膜糖蛋白，屬免疫球蛋白超家族(immunoglobulins superfamily, IGSF)的成員。Mel-CAM位于細胞膜表面，包括五個(gè)特征性的免疫球蛋白(Ig)樣結構域(V-V-C2-C2-C2)，一個(gè)跨膜區和一個(gè)細胞漿內短尾，與許多細胞黏附分子(cell adhesion molecule, CAM)有同源性［1］。最早發(fā)現Mel-CAM在黑素瘤細胞上表達，參與細胞間及細胞-細胞外基質(zhì)間黏附，在正常組織細胞間的黏附和腫瘤細胞的黏附、浸潤和轉移中均起到重要的作用［2］。后來(lái)發(fā)現Mel-CAM是一個(gè)高敏感和特異的IT標記物，在絨毛滋養細胞柱和絨毛外中間型滋養細胞的所有亞型中表達，而在CT和ST中則無(wú)，為IT代表滋養細胞的一個(gè)獨特亞群的觀(guān)點(diǎn)提供了更進(jìn)一步的證據［3］，并且在絨毛植入、胎盤(pán)形成和滋養細胞腫瘤的浸潤轉移中起到重要作用。因此，在正常胚胎種植和妊娠滋養細胞疾病中得到了廣泛的研究。通過(guò)我們的研究也發(fā)現，Mel-CAM表達僅限于正常絨毛和葡萄胎組織中的IT，故可作為一種標記物以區分起源于不同滋養細胞群的病變，如超常胎盤(pán)部位、胎盤(pán)部位滋養細胞腫瘤及絨癌等的鑒別診斷，為臨床病理學(xué)的工作提供了很大地便利條件。
　　
　　本研究中，正常早孕絨毛組織的Mel-CAM僅表達于滋養細胞柱和浸潤蛻膜的絨毛外IT中，而絨毛表面的滋養細胞無(wú)表達。該結果與一些學(xué)者的研究相一致［4-5］。眾所周知，胚胎植入的過(guò)程主要是依賴(lài)滋養細胞柱及絨毛外滋養細胞對子宮蛻膜的侵襲浸潤完成的，說(shuō)明Mel-CAM與滋養細胞的黏附浸潤有關(guān)。Shih等［6］認為子宮平滑肌細胞可能表達Mel-CAM受體，該受體與IT表面上的Mel-CAM蛋白相結合，從而參與了種植過(guò)程中滋養細胞在子宮內膜和肌層內的浸潤，而侵襲性較強的葡萄胎組織中Mel-CAM的表達較正常絨毛明顯增加，二者間差異有統計學(xué)意義(P<0.05)，也進(jìn)一步證明了Mel-CAM與滋養細胞浸潤能力有關(guān)。有學(xué)者認為［2］，腫瘤細胞間Mel-CAM和Mel-CAM受體的相互作用引起了腫瘤細胞的聚集，而Mel-CAM陽(yáng)性的內皮細胞則可介導腫瘤細胞貼附于血管內皮，侵入周?chē)�組織�？梢�(jiàn)，Mel-CAM在正常胚胎植入、滋養細胞的分化以及滋養細胞的黏附浸潤過(guò)程中都起到了重要的作用，可以作為一個(gè)臨床上預測妊娠滋養細胞疾病的侵蝕能力，判斷疾病的惡性程度的輔助工具。
　　
　　在正常絨毛和葡萄胎組織中，Mel-CAM的免疫染色特征相同，為IT表面均勻一致的線(xiàn)性染色，CT和ST均無(wú)表達。但是，二者在絨毛表面的表達模式不同。正常早孕絨毛中，Mel-CAM在絨毛表面無(wú)表達，僅見(jiàn)于滋養細胞柱和絨毛外滋養細胞中。這顯示了正常早孕絨毛中CT的兩個(gè)不同的分化方向：絨毛表面的CT直接融合為成熟的ST；而在滋養細胞柱上經(jīng)過(guò)了IT這個(gè)中間過(guò)渡階段。而葡萄胎中Mel-CAM的表達既可見(jiàn)于絨毛表面，也可見(jiàn)于浸潤的IT中。這說(shuō)明在葡萄胎組織絨毛表面的CT分化失調，不僅可以直接分化為ST，也可經(jīng)過(guò)IT分化為ST，表現出雙重分化途徑。這種分化模式與葡萄胎的發(fā)病機制間有何關(guān)系還有待于進(jìn)一步的研究。
　　
　　Ki-67是目前國際上研究非常多的一個(gè)細胞增殖標記物。Ki-67蛋白被認為普遍存在于細胞核中，與增生密切相關(guān)，可在除G0期外的所有細胞周期中表達，具有許多細胞周期調節蛋白的特征。有學(xué)者認為它涉及了細胞周期的檢查點(diǎn)控制機制［7］�，F在Ki-67已經(jīng)被廣泛用于檢測腫瘤組織中細胞的增生情況，在乳腺癌、胃癌、結腸癌、黑色素瘤等多種腫瘤中的表達顯著(zhù)增高，被認為是一個(gè)非常有價(jià)值的增殖標記物。正常早孕絨毛組織中Ki-67主要在CT中表達，而ST中則無(wú)陽(yáng)性染色［8］。眾所周知，正常早孕時(shí)，CT為滋養細胞的干細胞，細胞核分裂活躍，隨著(zhù)CT的分化，其浸潤能力增高而增殖能力喪失。ST是已經(jīng)分化成熟的細胞，徹底喪失了增殖能力。因此，CT中可見(jiàn)陽(yáng)性表達，而ST內未見(jiàn)到陽(yáng)性染色。這是與滋養細胞的生物學(xué)功能相一致的。在葡萄胎中，滋養細胞的增殖分化失控，不僅在絨毛基底部的CT中有Ki-67的表達，浸潤的IT中也可見(jiàn)大量陽(yáng)性染色。提示葡萄胎中，滋養細胞浸潤能力增加的同時(shí)其增殖能力不僅沒(méi)有喪失，反而有所提高，導致了疾病的發(fā)生。比較正常絨毛和葡萄胎組織中IT的Ki-67標記指數，后者明顯增高，二者間差異有統計學(xué)意義。說(shuō)明檢測葡萄胎組織中IT的Ki-67指數對于預測葡萄胎的轉歸有潛在的價(jià)值。
　　
　　綜上所述，Mel-CAM是一個(gè)非常有價(jià)值的標記物。它的發(fā)現為研究IT在妊娠滋養細胞疾病中的作用，以及滋養細胞的黏附、浸潤和轉移有很大的幫助。在正常胚胎著(zhù)床和妊娠滋養細胞疾病的發(fā)生發(fā)展中起到了不可替代的作用，具有廣泛的應用前景。而異常增殖的IT在妊娠滋養細胞疾病的發(fā)生發(fā)展以及疾病的特征中擔任了重要的角色，仍需要進(jìn)一步的研究。

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