醫學(xué)專(zhuān)業(yè)研究白血病課題畢業(yè)論文
1 材料
白花蛇舌草由江西藥都樟樹(shù)中藥飲片有限公司生產(chǎn)，批號20080701。將白花蛇舌草高速粉碎成碎片狀，浸泡于盛有10倍量藥材的蒸餾水的圓底燒瓶中12 h后，煎煮3次，收集濾液進(jìn)行抽濾濃縮，將濃縮液置于旋轉蒸發(fā)器中，濾液蒸發(fā)成粉末，再將粉末準確稱(chēng)重并溶于三蒸水，濾過(guò)除菌，配成濃度為220 mg/ml的白花蛇舌草水提液備用。噻唑藍（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）為Sigma公司產(chǎn)品，RPMI1640為Gibco公司產(chǎn)品，小牛血清（FBS）為杭州四季青生產(chǎn)，凋亡檢測試劑盒為北京保賽生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。
2 方法
2.1 細胞培養白血病CEM細胞株本實(shí)驗室保存。培養基為含體積分數為10%的FBS的RPMI1640，并加入雙抗（青霉素100 U/ml和鏈霉素100μg/ml）。在37℃、5% CO2、飽和濕度的培養箱（Therno Forma公司產(chǎn)品）中培養。取對數生長(cháng)期細胞進(jìn)行實(shí)驗。
2.2 MTT比色實(shí)驗將CEM細胞懸液離心（1 500 r/min、8 min），臺朌藍拒染法進(jìn)行細胞計數，調整細胞終濃度為3×105/ml進(jìn)行實(shí)驗，將細胞懸液接種于96孔培養板，每孔190 μl，24 h后，實(shí)驗組分別加入6種不同濃度的白花蛇舌草溶液（終濃度分別為0.005 12，0.025 6，0.128，0.64，3.2，16 μg/ml）10 μl，對照組不加藥，微振蕩，另設空白組（只有培養基，無(wú)細胞）每組6個(gè)復孔，培養于3個(gè)時(shí)間段（24，48，72 h）后，每孔加MTT（5 mg/ml）20 μl，繼續培養4 h后，離心（1 500 r/min、8 min），棄上清液，每孔加DMSO 150 μl，避光微振蕩，讓甲臜溶解充分，置于自動(dòng)酶標儀，測490 nm處的吸光度（A490）值。抑制率（%）=［（對照組A值-實(shí)驗組A值）/對照組A值］×100%。
2.3 形態(tài)學(xué)觀(guān)察白花蛇舌草作用于CEM細胞時(shí)間和濃度同MTT比色實(shí)驗，在倒置顯微鏡下觀(guān)察實(shí)驗組和對照組CEM細胞的一般情況并照像；CEM細胞懸液離心涂片，Giemsa染色，油鏡下觀(guān)察細胞形態(tài)；取白花蛇舌草3個(gè)濃度（0.025 6，0.128，0.64 μg/ml）作用于CEM細胞，兩個(gè)時(shí)間段（24，48 h）后，制成超薄切片，在透視電鏡下觀(guān)察細胞超微結構及凋亡小體。
2.4 流式細胞術(shù)（FCM）分析白花蛇舌草3個(gè)濃度（0.025 6，0.128，0.64 μg/ml），作用于CEM細胞兩個(gè)時(shí)間段（24，48 h）后，細胞用PBS洗兩遍，70%乙醇固定，重懸于PBS中調整細胞濃度為1×106/ml，取100 μl，加碘化吡啶（PI）1 ml，輕輕混勻置4℃冰箱30 min，上機檢測（流式儀為 BECTON DTCKINSON，B.D公司產(chǎn)品），采用CenQuest軟件上機獲取10 000個(gè)細胞，ModFitlt軟件分析并統計結果。
3 結果
白花蛇舌草對白血病CEM細胞生長(cháng)的影響不同時(shí)間和劑量白花蛇舌草對CEM細胞生長(cháng)的影響見(jiàn)表1。0.025 6 μg/ml的白花蛇舌草即可顯著(zhù)抑制CEM細胞生長(cháng)，半數抑制濃度（IC50）約為0.128 μg/ml，從表1可見(jiàn)，白花蛇舌草對CEM細胞的抑制作用具有時(shí)間和劑量依賴(lài)性，抑制率隨劑量增高、時(shí)間延長(cháng)而增大。
本實(shí)驗結果顯示，白花蛇舌草處理白血病CEM細胞后，能顯著(zhù)抑制其生長(cháng)。抑制率具有時(shí)間和劑量依賴(lài)性，隨著(zhù)作用時(shí)間的延長(cháng)，藥物劑量的增大，抑制率逐步提高。光鏡顯示，細胞體積縮小，核濃染，細胞數量與對照組比較大為減少。電鏡證明，形態(tài)學(xué)呈現典型的凋亡特征性改變，核染色質(zhì)凝集，沿核膜周邊聚集呈新月形，胞膜內陷包裹變性的細胞內容物成凋亡小體，這些變化是確認細胞凋亡的十分可靠的方法［5］。流式細胞術(shù)進(jìn)一步說(shuō)明白花蛇舌草能誘導CEM細胞凋亡。
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