葡萄糖鉗夾技術(shù)的建立
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【摘要】 目的： 建立能精確測定胰島素敏感性的高胰島素?正常葡萄糖鉗夾技術(shù). 方法： 應用高胰島素?正常葡萄糖鉗夾技術(shù)對10名正常體質(zhì)量、正常糖耐量的健康志愿者進(jìn)行方法學(xué)研究. 結果： 鉗夾試驗開(kāi)始后，血漿胰島素濃度迅速上升并維持在100 mU/L左右，空腹血糖維持在正常水平(5.0 mmol/ L)，試驗過(guò)程中內源性胰島素和肝糖源輸出得到完全抑制，血液升糖激素濃度 (包括皮質(zhì)醇和生長(cháng)激素) 與基礎值相比無(wú)明顯上升. 鉗夾穩態(tài)期，葡萄糖輸注率為 (11.56±1.74) mg/(kg·min). 結論： 高胰島素?正常葡萄糖鉗夾技術(shù)已成功建立. 在高胰島素?正常葡萄糖穩態(tài)條件下，葡萄糖輸注率等于機體的葡萄糖利用率，葡萄糖輸注率可以作為評價(jià)組織對外源性胰島素敏感性的指標.
【關(guān)鍵詞】 胰島素 葡萄糖鉗制技術(shù) 胰島素抗藥性 胰島素敏感性
引言
高胰島素?正常葡萄糖鉗夾技術(shù) (hyperinsulinemic?euglycemic clamp) 是目前世界上公認評價(jià)機體胰島素敏感性的金標準，已在基礎及臨床醫學(xué)研究領(lǐng)域中得到廣泛應用，并且已擴展應用于許多病理狀態(tài)、藥物或非藥物防治措施的機制研究中. 建立和開(kāi)展高胰島素?正常葡萄糖鉗夾技術(shù)對于糖尿病基礎和臨床研究具有重要意義，但由于此方法操作復雜、價(jià)格昂貴且費時(shí)，國內僅有數家醫院開(kāi)展此技術(shù). 我院內分泌科自2006年引進(jìn)葡萄糖鉗夾系統以來(lái)，根據DeFronzo等[1]所建立經(jīng)典鉗夾技術(shù)的原理并結合國內外近年來(lái)的研究進(jìn)展，成功建立了高胰島素?正常葡萄糖鉗夾技術(shù).
1對象和方法
1.1對象10 (男5，女5)名正常健康志愿者，年齡27.0 ± 4.4 (23~37)歲，體質(zhì)量指數20.3 ± 1.2 (19.2~23.2) kg/m2，無(wú)糖尿病、高血壓病家族史，血脂譜正常，肝、腎功能及血尿酸濃度均在正常范圍，未服用任何可能影響胰島素敏感性的藥物，口服75 g葡萄糖耐量試驗均為正常糖耐量者 (按2003年ADA標準). 試驗前3 d受試者每日碳水化合物飲食不少于200 g，體質(zhì)量保持穩定. 試驗前向受試者解釋試驗的性質(zhì)、目的及可能發(fā)生的不良反應，所有受試者均自愿參加試驗并簽署知情同意書(shū).
1.2方法受試者檢查前空腹12 h，早8:00到達檢查室，測量身高、體質(zhì)量，排空小便后清醒靜臥于檢查床30 min后開(kāi)始試驗. 先分別于受試者雙側前臂行靜脈穿刺，利用三通管組成2條靜脈通道. 一側用于輸注胰島素及200 mL/L葡萄糖液 (連接于Injectomat C?IS和INCA?ST容積泵，德國Fresenius公司);另一側用于試驗中采血 (將此側前臂置于60℃恒溫儀中，以保證靜脈血動(dòng)脈化[2])，不采血時(shí)緩慢靜滴生理鹽水，采血前臨時(shí)關(guān)閉輸液器.
鉗夾開(kāi)始10 min內以4 mU/(kg·min)速率輸注人胰島素溶液 (諾和靈R，40000 U/L，丹麥Novo Nordisk公司) 使血液胰島素濃度迅速升高，隨后110 min內以2 mU/(kg·min)速率持續輸注. 在此期間每5 min測一次靜脈血糖值 (BIOSEN5030血糖分析儀，葡萄糖氧化酶電極法，德國)，根據血糖值調整200 mL/L葡萄糖液輸注率，使受試者血糖值維持在5.0 mmol/L左右. 每10 min采靜脈血測定血清胰島素濃度，每30 min測定血清C肽、皮質(zhì)醇和生長(cháng)激素濃度 (化學(xué)發(fā)光法，藥盒購自天津德普診斷產(chǎn)品有限公司). 試驗結束時(shí)收集試驗期間尿標本，測定尿糖值 (測定方法同血糖測定). 所有血標本均經(jīng)離心分離血清，-80℃冰箱保存至同批測定.
統計學(xué)處理： 試驗結束后計算各受試者試驗中血糖值均數(x)、標準差(s)及變異系數(CV)，計算試驗中每10 min的平均葡萄糖輸注率(glucose infusion rate, GIR)、機體總葡萄糖利用率 (鉗夾開(kāi)始 20~120 min內平均GIR) 和最大葡萄糖利用率 (鉗夾穩態(tài)期最后30 min平均GIR). 全部數據均采用SPSS 13.0軟件處理，計量資料以x±s表示，不同性別之間比較采用兩獨立樣本t檢驗.
2結果
全部受試者均成功完成鉗夾試驗，檢查結束后均未發(fā)生低血糖反應及其他異常反應，靜脈穿刺部位未發(fā)生感染及靜脈血栓形成. 結果顯示高胰島素?正常葡萄糖鉗夾技術(shù)成功建立.
2.1外源性胰島素?葡萄糖代謝穩態(tài)形成基礎血漿葡萄糖濃度為 (4.26±0.39) mmol/L，在高胰島素?正常葡萄糖鉗夾過(guò)程中，血糖穩定在 (4.99±0.15)mmol/L，穩態(tài)期血糖CV為 (3.09±1.29)%. 基礎血清胰島素濃度為 (3.81±2.20) mU/L，鉗夾試驗開(kāi)始后血清胰島素濃度迅速升高，于10 min時(shí)達到高峰 (133.70±21.91)mU/L，隨后維持在 (91.57±13.86)mU/L 至試驗結束. 基礎血清C肽濃度為(1.92±0.34)μg/L，整個(gè)鉗夾過(guò)程中C肽濃度為 (1.32±0.35)μg/L，各個(gè)時(shí)點(diǎn)的C肽濃度與基礎狀態(tài)相比呈逐漸下降趨勢 (圖1). 鉗夾穩態(tài)期與基礎狀態(tài)相比較，升糖激素如血皮質(zhì)醇、生長(cháng)激素的濃度無(wú)明顯上升，且均呈逐漸下降的趨勢 (圖2).
2. 2高胰島素?正常葡萄糖鉗夾過(guò)程中的血糖及葡萄糖輸注率變化鉗夾試驗過(guò)程中受試者血糖濃度穩定在 (4.99±0.15)mmol/L，試驗開(kāi)始40 min內GIR上升較快，達到 (9.45±3.17)mg/(kg·min)，此后上升趨于平緩，在90~120 min時(shí)均保持在穩態(tài) (圖3). 鉗夾開(kāi)始20~120 min內GIR為 (10.75±2.38)mg/(kg·min)，穩態(tài)期GIR為 (11.56±1.74)mg/(kg·min)，不同性別之間GIR [男 (10.53±1.57)mg/(kg·min)，女 (12.25±1.59)mg/(kg·min)] 差異無(wú)統計學(xué)意義(P=0.12).
3討論
1966年Andres依據糖代謝特點(diǎn)設計了高胰島素?正常葡萄糖鉗夾技術(shù)，1979年DeFronzo等[1]對該技術(shù)作了詳細研究并應用于人體，從此推動(dòng)了葡萄糖鉗夾技術(shù)在世界范圍內的應用，成為目前公認評價(jià)機體胰島素敏感性的“金標準”. 本研究按照DeFronzo等[1]的方法進(jìn)行設計，結果顯示形成穩定高胰島素狀態(tài)，達到完全抑制肝臟內源性葡萄糖輸出的目的;血糖鉗夾在正常水平，變異系數小于5%;試驗中內源性胰島素分泌被抑制，升糖激素無(wú)明顯釋放，符合高胰島素?正常葡萄糖鉗夾技術(shù)成功建立的標準[1]. 正常人體內胰島素濃度高于生理水平時(shí)肝糖輸出可以被完全抑制，故鉗夾試驗中當達到高胰島素穩態(tài)時(shí)外源性葡萄糖輸注率 (GIR) 等于外周組織的葡萄糖利用率 (M值)，此時(shí)GIR可作為評價(jià)機體胰島素敏感性的指標[1]. 賈偉平等[3]建立擴展高胰島素?正常葡萄糖鉗夾技術(shù)時(shí)穩態(tài)期胰島素濃度為(63.00±4.86) mU/L時(shí)肝糖產(chǎn)生為0，故計算M值時(shí)可忽略肝糖的產(chǎn)生. 當對存在胰島素抵抗的患者進(jìn)行正常葡萄糖鉗夾試驗時(shí)，經(jīng)典試驗中采用的胰島素輸注率所達到的穩態(tài)期胰島素濃度并不能完全抑制肝糖輸出[4].
研究表明，無(wú)論是糖尿病患者還是其他胰島素抵抗嚴重的患者，當采用較快的胰島素輸注率使穩態(tài)期胰島素濃度達到200 mU/L以上時(shí)，肝糖輸出幾乎被完全抑制，可以避免肝糖輸出影響試驗結果[5- 6]. 本組10名受試者鉗夾試驗時(shí)均采用2 mU/(kg·min)的胰島素輸注率，穩態(tài)期胰島素濃度與DeFronzo經(jīng)典試驗結果類(lèi)似[1]. 不同實(shí)驗室采用相同胰島素輸注率時(shí)穩態(tài)期胰島素濃度相差較大，可能與試驗具體操作、胰島素測定方法及受試者空腹胰島素濃度不同等因素有關(guān). 鉗夾穩態(tài)期胰島素濃度不同，GIR值也不同，一般穩態(tài)期胰島素濃度越高，GIR值越大[1, 3, 7-10]. 當對存在胰島素抵抗的患者進(jìn)行正常葡萄糖鉗夾試驗時(shí)，穩態(tài)期胰島素濃度較高，評價(jià)胰島素敏感性時(shí)可采用穩態(tài)期胰島素濃度加以較正[11].
綜上所述，高胰島素?正常葡萄糖鉗夾試驗中達到胰島素?葡萄糖代謝穩態(tài)后的外源性葡萄糖輸注率等于外周組織的葡萄糖利用率，葡萄糖輸注率 (GIR) 可作為評價(jià)機體胰島素敏感性的指標. 近年來(lái)鉗夾試驗中微量精確輸液泵和計算機技術(shù)的應用大大簡(jiǎn)化了試驗操作難度并提高了成功率，高胰島素?正常葡萄糖鉗夾技術(shù)將在糖尿病的預測、糖尿病發(fā)病機制研究等方面發(fā)揮重要作用.
【參考文獻】
[1] DeFronzo RA, Tobin JD, Andres R. Glucose clamp technique: A method for quantifying insulin secretion and resistance [J]. Am J Physiol, 1979, 237 (3): E214-E223.
[2] Abumrad NN, Rabin D, Diamond MP, et al. Use of a heated superficial hand vein as an alternative site for the measurement of amino acid concentrations and for the study of glucose and alanine kinetics in man [J]. Metabolism, 1981, 30 (9): 936-940.
[3] 賈偉平，陳蕾，項坤三，等. 擴展高胰島素?正葡萄糖鉗夾技術(shù)的建立 [J]. 中華內分泌代謝雜志, 2001, 17 (5): 268-271.
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