細胞培養在生物制藥領(lǐng)域的應用
本文對細胞培養技術(shù)在疫苗生產(chǎn)、單克隆抗體制備、藥物篩選、基因重組產(chǎn)品等生物制藥領(lǐng)域的應用作一綜述。
細胞培養在生物制藥領(lǐng)域的應用【1】
【摘 要】經(jīng)過(guò)長(cháng)時(shí)間的研究與實(shí)踐，細胞培養技術(shù)已經(jīng)得到了充分的發(fā)展與完善，離體培養的動(dòng)物細胞具有可以人為控制的培養條件且結果便于觀(guān)察的特點(diǎn)，因而被廣泛應用于生物制藥領(lǐng)域中并對該領(lǐng)域產(chǎn)生了巨大而深遠的影響。
本文對細胞培養技術(shù)在疫苗生產(chǎn)、單克隆抗體制備、藥物篩選、基因重組產(chǎn)品等生物制藥領(lǐng)域的應用作一綜述。
【關(guān)鍵詞】細胞培養 生物制藥 應用
隨著(zhù)生命科學(xué)理論和技術(shù)的飛速發(fā)展，細胞培養技術(shù)的地位和作用日益成熟，動(dòng)物細胞培養的研究取得了可觀(guān)的效果，并且有著(zhù)無(wú)限的應用發(fā)展前景。
主要的發(fā)展目標包括：開(kāi)發(fā)生長(cháng)密度高、目標產(chǎn)品分泌量大的細胞系;研制性能優(yōu)良、吸附與解離容易、重復利用的微載體;開(kāi)展規�；纳锓磻�、檢測系統、細胞培養與產(chǎn)物分離耦合系統等;設計新型培養基促進(jìn)生物制品安全;研究三維細胞的培養條件[1]。
生物制藥即運用生物化學(xué)、醫學(xué)、微生物學(xué)等原理和方法，利用生物機體、組織、細胞、體液等生產(chǎn)具有預防、診斷和治療功能的藥物制品。
有關(guān)研究者采用基因重組技術(shù)或其他創(chuàng )新生物技術(shù)生產(chǎn)治療性藥物，主要產(chǎn)品有基因工程藥物、抗體工程藥物、疫苗等幾類(lèi)。
這些產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)研制及生產(chǎn)過(guò)程都離不開(kāi)細胞培養技術(shù)。
1 疫苗生產(chǎn)
疫苗免疫是最有效的預防感染性疾病的措施之一。
疫苗免疫是指利用病毒性制劑、細菌性制劑及類(lèi)毒素等人工主動(dòng)免疫制劑，通過(guò)作用于機體的免疫防御系統起到免疫應答作用。
傳統的流感疫苗生產(chǎn)多采用雞胚培養，但當面臨高致病性流感全球大流行、微生物感染、內毒素殘余量多等問(wèn)題時(shí)，傳統的雞胚生產(chǎn)方法可能難以滿(mǎn)足疫苗市場(chǎng)的需求。
隨著(zhù)細胞培養技術(shù)的完善及其優(yōu)點(diǎn)的體現積極推進(jìn)使用細胞培養技術(shù)替代雞胚培養技術(shù)生產(chǎn)流感疫苗，未來(lái)將會(huì )越來(lái)越多依靠細胞培養技術(shù)獲得理想的疫苗。
與此同時(shí)也存在一些缺陷，尤其是哺乳動(dòng)物細胞培養的病毒疫苗特別適合于工業(yè)的發(fā)展，應用微載體大規模培養細胞生產(chǎn)流感疫苗，使得流感病毒適應傳代細胞(如VERO細胞)，該細胞不僅培養條件要求不高而且遺傳性狀穩定，對多種病毒的感染敏感[2]，如利用生物反應器大規模進(jìn)行病毒繁殖，可實(shí)現流感疫苗的規�；a(chǎn)。
MDCK細胞系是被公認為最適于生產(chǎn)甲、乙型流感病毒疫苗的細胞系，對流感病毒增殖快、感染效率高，且不易變異[3]。
其中典型代表，如巴斯德公司利用1000L反應器微載體培養Vero細胞生產(chǎn)人用狂犬病疫苗和脊髓灰質(zhì)炎疫苗。
由此可見(jiàn)，利用細胞培養疫苗已成為目前疫苗研制的重要應用方向。
2 單克隆抗體制備
單克隆抗體是由單一B淋巴細胞克隆產(chǎn)生的高度均一、僅針對某一特定抗原表位的抗體。
研究Hb在帕金森病中的發(fā)病機制，李旭穎等[4]制備抗Hb單克隆抗體，由重組人Hb作為抗原免疫小鼠，并將其細胞融合及細胞培養制備成雜交瘤，經(jīng)過(guò)篩選獲得抗人Hb單克隆抗體雜交瘤株，體內誘生法制備腹水經(jīng)過(guò)酶聯(lián)免疫吸附試驗等方法進(jìn)而獲得特異性抗Hb單克隆抗體。
張培等[5]制備乙型腦炎病毒的單克隆抗體通過(guò)動(dòng)物免疫、細胞融合、克隆和篩選等方法，應用ELISA等免疫學(xué)方法進(jìn)行特異性和亞型的鑒定，為快速檢測方法的建立奠定了基礎。
單克隆抗體藥物研發(fā)已經(jīng)被列入863計劃和國家重點(diǎn)項目，國內已經(jīng)有2個(gè)治療性單抗產(chǎn)品準備生產(chǎn)，3個(gè)治療性產(chǎn)品處于臨床試驗階段，多個(gè)抗體藥物處于臨床研究階段，已經(jīng)批準的治療性單抗有31個(gè)，目前國內正在進(jìn)行臨床前研究的抗體藥物有：抗CEA嵌合抗體;抗破傷風(fēng)抗體及抗乙型腦炎等[6]。
3 藥物篩選
藥物篩選是從天然或合成的化合物中篩選出高效的新藥或先導化合物。
生物活性和藥理作用檢測所篩選出的高效的新藥或先導化合物，并根據檢測結果評價(jià)某一物質(zhì)的藥用前景，是新藥研究的最初過(guò)程和關(guān)鍵步驟。
體外二維和應用球狀聚集體、細胞片層、脫細胞基質(zhì)進(jìn)行三維培養肝細胞的具體技術(shù)是進(jìn)行藥物毒性檢測的重要途徑[7]。
Kostadinava等建立了一種長(cháng)時(shí)間的三維肝細胞共培養體系，比單層培養肝細胞能更好地檢測體內藥物導致的毒性。
細胞水平的藥物篩選更接近人體生理狀態(tài)，外界環(huán)境干擾少，準確率高，是細胞水平藥物篩選模型的核心技術(shù)高內涵篩選。
高內涵藥物篩選主要在微陣列多孔板上完成，通過(guò)在微孔板上進(jìn)行細胞培養，施加藥物刺激進(jìn)行實(shí)驗操作和數據的采集和分析。
HCS技術(shù)可完成各種對于細胞生理現象本質(zhì)的研究，Talyor等[8]提出高內涵概念，HCS模型主要建立在細胞水平，通過(guò)觀(guān)察樣品對固定或動(dòng)態(tài)細胞的多個(gè)功能的作用，涉及各種不同的靶點(diǎn)，從多個(gè)角度分析樣品的作用，最終確定樣品的活性和可能的毒性。
近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的微流控芯片技術(shù)有可能成為細胞水平藥物篩選的理想選擇。
Ye等[9]構建了一套用于細胞水平藥物篩選研究的集成化微流控芯片系統，它可以將細胞種植、培養、標記、加藥、梯度稀釋等操作通過(guò)微通道網(wǎng)絡(luò )流體控制技術(shù)集成到一張芯片完成，保持了細胞結構的完整性，可全面記錄細胞對藥物刺激的各種反應。
4 基因重組產(chǎn)品
基因工程藥物是將人某一部位的基因，注入到質(zhì)粒中，然后導入工程菌或工程細胞中，經(jīng)細胞培養或細菌培養，充分表達擴增后，分離，純化而得。
基因重組產(chǎn)品與天然型的生物學(xué)活性一致，其結構分為兩種，一種與天然型的一樣;另一種稍有區別，如人白細胞介素是糖蛋白質(zhì)，但糖鏈的有無(wú)對其機能無(wú)影響，故重組的不含糖鏈。
哺乳動(dòng)物細胞已成為生物制藥最重要的表達或生產(chǎn)系統，FDA(美國食品藥品管理局)在2000年以后批準的創(chuàng )新生物技術(shù)藥物，用酵母表達的有2種，用大腸桿菌表達的產(chǎn)品只有4種，而通過(guò)動(dòng)物細胞培養生產(chǎn)的生物技術(shù)產(chǎn)品則有22種，除兩種組織工程產(chǎn)品外，其余都是蛋白類(lèi)產(chǎn)品，這些蛋白都是分子量大、二硫鍵多、空間結構復雜的糖蛋白，只有使用CHO等哺乳動(dòng)物細胞表達系統，這些蛋白的生產(chǎn)才成為可能。
建立CHO細胞表達的重組人白細胞介素-12(rhIL-12)的純化工藝，趙峰等[10]取高效表達rhIL-12的CHO工程細胞培養上清液，分離純化、定量計算、對純化產(chǎn)品進(jìn)行鑒定及檢測rhIL-12的生物活性，經(jīng)檢測發(fā)現純化產(chǎn)物回收率和純度高，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。
細胞大規模培養技術(shù)在生物制藥中的應用【2】
【摘 要】動(dòng)物細胞培養基是體外細胞培養的重要因素,能夠影響細胞生長(cháng)。
它是利用動(dòng)物細胞體外培養和擴增來(lái)生產(chǎn)生物產(chǎn)品，或者作為發(fā)現和測試新的工具。
為此本文就動(dòng)物細胞培養基的發(fā)展及應用進(jìn)行了簡(jiǎn)要的介紹。
【關(guān)鍵詞】生物制藥;動(dòng)物細胞培養;應用
一、動(dòng)物細胞的特點(diǎn)及生長(cháng)特性
動(dòng)物細胞雖可像微生物細胞一樣，在人工控制條件的生物反應器中進(jìn)行大規模培養，但其細胞結構和培養特性與微生物細胞相比，有顯著(zhù)差別：①動(dòng)物細胞比微生物細胞大得多，無(wú)細胞壁，機械強度低，對剪切力敏感，適應環(huán)境能力差;②倍增時(shí)間長(cháng)，生長(cháng)緩慢，易受微生物污染，培養時(shí)須用抗生素;③培養過(guò)程需氧量少;④培養過(guò)程中細胞相互粘連以集群形式存在;⑤原代培養細胞一般繁殖50代即退化死亡;⑥代謝產(chǎn)物具有生物活性，生產(chǎn)成本高，但附加值也高。
二、動(dòng)物細胞大規模培養技術(shù)的發(fā)展
動(dòng)物細胞大規模培養技術(shù)生產(chǎn)大分子的生物制品起始于20世紀60年代，當時(shí)是為了滿(mǎn)足生產(chǎn)疫苗的需要。
后來(lái)隨著(zhù)大規模培養技術(shù)的逐漸成熟和轉基因技術(shù)的發(fā)展與應用，人們發(fā)現利用動(dòng)物細胞大規模培養技術(shù)來(lái)生產(chǎn)大分子藥用蛋白質(zhì)比原核細胞表達系統更有優(yōu)越性。
因為重組DNA技術(shù)修飾過(guò)的動(dòng)物細胞能夠正常地加工、折疊、糖基化、轉運、組裝和分泌由插入的外源基因所編碼的蛋白質(zhì)，而細菌系統的表達產(chǎn)物則常以沒(méi)有活性的包含體形式存在。
隨著(zhù)大量永生性細胞株的創(chuàng )建，在商業(yè)利益的刺激下，動(dòng)物細胞大規模培養技術(shù)也迅速發(fā)展起來(lái)，并被應用到生產(chǎn)實(shí)際。
動(dòng)物細胞培養主要用于生產(chǎn)激素、疫苗、單克隆抗體、酶、多肽等功能性蛋白質(zhì)，以及皮膚、血管、心臟、大腦、肝、腎、腸等組織器官。
它在醫藥工業(yè)和醫學(xué)工程的發(fā)展中占重要地位。
大規模動(dòng)物細胞培養生產(chǎn)藥物產(chǎn)品將是生物制藥領(lǐng)域的一個(gè)很重要的方面，具有重大的經(jīng)濟效益和社會(huì )效益。
生物技術(shù)在過(guò)去10年有顯著(zhù)增長(cháng)，并繼續快速發(fā)展，今后幾十年內還將有更多的蛋白質(zhì)、抗體、多肽類(lèi)藥物由動(dòng)物細胞培養來(lái)生產(chǎn)。
隨著(zhù)生物技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，開(kāi)發(fā)的動(dòng)物細胞生產(chǎn)生物制品的種類(lèi)的增多及產(chǎn)品周期短、安全高等優(yōu)點(diǎn)，利用動(dòng)物細胞進(jìn)行大規模生產(chǎn)生物制品凸顯其優(yōu)越性的發(fā)展越來(lái)越快。
三、大規模細胞培養技術(shù)的應用
近幾年來(lái)，已把巨大的人力和資金投入到開(kāi)發(fā)大規模細胞培養技術(shù)上，將能加快發(fā)展步伐，進(jìn)一步應用遺傳修飾的哺乳動(dòng)物細胞生產(chǎn)單克隆抗體和其他精細的糖蛋白。
獲得有藥物作用的蛋白質(zhì)是十分復雜的過(guò)程，要求分子有精確的折疊和糖基化，這些要求在細菌和酵母體內卻難以得到滿(mǎn)足。
然而，采用雜交瘤和重組DNA技術(shù)往往可以使動(dòng)物細胞產(chǎn)生和分泌出一定數量的有用蛋白質(zhì)。
大規模的動(dòng)物細胞培養在藥物產(chǎn)品的生產(chǎn)方面具有重大的價(jià)值。
1.疫苗
在疫苗產(chǎn)業(yè)早期，往往利用動(dòng)物來(lái)生產(chǎn)疫苗，如用家兔人工感染狂犬病毒生產(chǎn)狂犬疫苗，用奶牛來(lái)生產(chǎn)天花疫苗，用某些細菌接種到動(dòng)物身上來(lái)生產(chǎn)抵抗該種細菌的疫苗。
早在20世紀50年代，已經(jīng)能夠利用動(dòng)物細胞培養技術(shù)生產(chǎn)病毒。
先在反應器中大規模培養動(dòng)物細胞，待細胞長(cháng)到一定密度后.接種病毒，病毒利用培養的細胞進(jìn)行復制，從而生產(chǎn)大量的病毒。
這一突破是動(dòng)物細胞工程的真正開(kāi)始。
雖然動(dòng)物細胞培養技術(shù)發(fā)展迅速，大大降低了實(shí)驗動(dòng)物的用量，提高廠(chǎng)生產(chǎn)效率，但由于原代細胞增殖能力有限，一般只能通過(guò)簡(jiǎn)單增加動(dòng)物的數量來(lái)增加產(chǎn)量。
而使用具有無(wú)限增殖潛力的細胞系，則使疫苗的生產(chǎn)得到飛躍式的進(jìn)展。
某些來(lái)自人體或動(dòng)物體內的細胞，在一定條件下的體外培養后，可以獲得無(wú)限增殖的潛力，用它們來(lái)生產(chǎn)疫苗可以大大降低實(shí)驗動(dòng)物的用量。
更為重要的是，用動(dòng)物細胞體外大規模培養技術(shù)生產(chǎn)的疫苗可以保證質(zhì)量，因為所用的細胞性質(zhì)均一，經(jīng)過(guò)嚴格的安全檢驗，克服了動(dòng)物個(gè)體間的差異造成的疫苗質(zhì)量不穩定的問(wèn)題，并且大大降低了來(lái)自動(dòng)物的病原體傳染使用者的可能性。
用類(lèi)似的細胞培養技術(shù)可生產(chǎn)酶、細胞因子、抗體等生物制品，其先決條件是能夠獲得可分泌目標蛋白的細胞系。
但是，在基因工程技術(shù)出現之前，細胞表達蛋白的水平很低，因而用這種工藝生產(chǎn)蛋白制品產(chǎn)量低、成本高，因此早期的動(dòng)物細胞技術(shù)只用于疫苗及少量的干擾素和尿激酶的生產(chǎn)。
基因重組技術(shù)和雜交瘤技術(shù)大大促進(jìn)了動(dòng)物細胞技術(shù)的進(jìn)步及其在工業(yè)領(lǐng)域的應用，使動(dòng)物細胞大規模培養技術(shù)在生產(chǎn)疫苗中越來(lái)越重要。
傳統上一直把細胞培養產(chǎn)物用于人類(lèi)和牲畜的病毒疫苗，這些疫苗至今己被大規模應用。
口蹄疫疫苗是大規模動(dòng)物細胞培養方法生產(chǎn)的主要產(chǎn)品之一。
1983年，英國Wellcome公司就已能夠利用動(dòng)物細胞進(jìn)行大規模培養生產(chǎn)口蹄疫疫苗。
美國Genentech公司應用SV40為載體，將乙型肝炎病毒表面抗原基因插入哺乳動(dòng)物細胞內進(jìn)行高效表達，已生產(chǎn)出乙型肝炎疫苗。
2.單克隆抗體
單克隆抗體在體外診斷、體內造影、人和家畜的治療以及工業(yè)上的應用日益廣泛，需要量可達數百克。
有些系統的單克隆抗體的需要量在今后幾年內將迅速增加到幾公斤的數量級。
為此，迫切需要更有效的生產(chǎn)方法。
采用傳統方法(小鼠或大鼠的腹水瘤培養法)生產(chǎn)單克隆抗體，已不能適應實(shí)際需要。
應用大規模細胞培養系統生產(chǎn)各種不同的單克隆抗體是經(jīng)濟可靠的方法。
如英國Celltech公司采用10100和10001自動(dòng)氣升式培養系統，培養各種生產(chǎn)單克隆抗體的小鼠、大鼠和人的細胞株，生產(chǎn)各種單克隆抗體的產(chǎn)品。
到目前為止，已成功地在1000L培養系統中，采用無(wú)血清培養液生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的單克隆抗體。
其他一些國家先后制備成測定血和尿中的各種激素、特殊蛋白質(zhì)、血型、各種藥物、診斷細菌性或病毒性病原等的單克隆抗體診斷試劑盒。
3.基因重組產(chǎn)品
目前已認識到在不久將來(lái)用常規的微生物學(xué)方法不能實(shí)現遺傳工程的效益，人們對大規模細胞培養的興趣愈來(lái)愈大。
動(dòng)物細胞能精確地轉譯和加工較大或更復雜的克隆蛋白質(zhì)。
此外，動(dòng)物細胞還可以把人們所需的蛋白質(zhì)分泌到培養液內，而從培養液分離蛋白質(zhì)要比細胞勻漿更為容易。
除了單克隆抗體外，現在人們最感興趣的蛋白質(zhì)是組織型的血纖蛋白溶酶原激劑(t%26mdash;PA)，以及其他的重組分子。
利用動(dòng)物細胞培養方式進(jìn)行大量生產(chǎn)，如免疫珠蛋白G、A和M，尿激酶，人生長(cháng)激素，乙型肝炎表面抗原等產(chǎn)品均由美國Endotronic公司用Acusyst%26mdash;P型中空纖維培養系統進(jìn)行生產(chǎn)。
參考文獻
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[3]唐瑩,馮君.;動(dòng)物細胞培養的發(fā)展及應用 [J].中國臨床康復,2006年41期
無(wú)細胞蛋白表達體系在生物制藥工程中的應用【3】
[摘要]作為體外合成蛋白表達手段的一種，無(wú)細胞蛋白表達體系有著(zhù)蛋白合成高效快速、反應操縱簡(jiǎn)便等方面的優(yōu)點(diǎn)，在基礎生物學(xué)領(lǐng)域的研究中有著(zhù)廣泛的應用價(jià)值。
無(wú)細胞蛋白表達體系目前已成功應用于重組蛋白藥物的生產(chǎn)。
高通量藥物篩選等領(lǐng)域，為解決生物制藥領(lǐng)域中的難題提供了新的解決思路。
同時(shí)，經(jīng)過(guò)研究人員的不斷努力，對其在生物制藥工程中的應用也取得了新的研究進(jìn)展，顯示出重要的應用潛能。
本文基于對無(wú)細胞蛋白表達體系的闡述和分析，對其在生物制藥工程中的應用做出了相關(guān)的探討和研究，以期能為生物制藥領(lǐng)域的發(fā)展提供一定的技術(shù)支撐和借鑒。
[關(guān)鍵詞]生物：制藥工程;無(wú)細胞蛋白;表達體系;應用
隨著(zhù)生物科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們對蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)的前沿領(lǐng)域的研究越來(lái)越關(guān)注，無(wú)細胞蛋白表達體系(cell-free protein synthesis，CFPS)也因此備受重視。
尤其是近些年來(lái)，無(wú)細胞蛋白表達體系的研究已逐漸從原核深入到真核的反應體系，成本不斷降低。
較之于傳統的體內表達體系，無(wú)細胞蛋白表達體系基于細胞提取物，有著(zhù)不受細胞的生理限制以及胞內蛋白酶的降解、可以在較短的時(shí)間內進(jìn)行大量的毒性蛋白表達、無(wú)需繁雜的下游處理以及產(chǎn)物的活性增加等諸多方面的應用優(yōu)勢。
同時(shí)，其在生物制藥中也逐漸體現出了毒性蛋白、復雜蛋白以及膜蛋白表達等方面的優(yōu)勢。
但由于天然蛋白水溶性差、半衰期短等因素的影響，如何實(shí)現重組蛋白的穩定表達，發(fā)揮無(wú)細胞蛋白表達體系在醫療方面的應用潛力，就成為生物制藥領(lǐng)域的重要研究課題。
因此，本文討論和研究無(wú)細胞蛋白表達系統在生物制藥工程中的有效應用問(wèn)題，將對更好地實(shí)現該系統在制藥科學(xué)領(lǐng)域應用潛力的發(fā)揮有著(zhù)重要的理論和現實(shí)意義。
1.無(wú)細胞蛋白表達體系概述
作為一種生物學(xué)技術(shù)，傳統的蛋白表達是基于細胞體內，對動(dòng)植物細胞以及細菌等外源基因的表達。
而無(wú)細胞蛋白合成系統是一種全新的蛋白合成方式，實(shí)現了以外源DNA或mRNA為模板，利用細胞抽取物中的蛋白因子、相關(guān)的酶系等，通過(guò)在體系內加入ATP、GTP以及氨基酸、能量再生物質(zhì)等來(lái)實(shí)現蛋白表達的體外系統(如圖1所示)。
自1982年世界上第一個(gè)重組蛋白藥物胰島素問(wèn)世以來(lái)，重組蛋白藥物由于來(lái)源廣泛，且有著(zhù)較高的安全性在短短幾十年時(shí)間就實(shí)現了在生物制藥領(lǐng)域的飛速發(fā)展，在全球藥物市場(chǎng)上越來(lái)越占據著(zhù)舉足輕重的地位。
表達重組蛋白藥物最常用的系統包括大腸桿菌、�酒酵母以及中國的倉鼠卵巢細胞。
但諸如此類(lèi)的體內表達系統往往由于種種原因而導致一些復雜蛋白不能順利表達，在這一迫切需求下，無(wú)細胞蛋白表達技術(shù)便應運而生。
隨著(zhù)國內外學(xué)者對蛋白合成技術(shù)的深入研究以及蛋白連續翻譯系統的建立，無(wú)細胞表達也有了突破性的研究，實(shí)現了蛋白的連續表達。
該系統無(wú)需在活體細胞內進(jìn)行，基于細胞提取物就可以實(shí)現連續的轉錄和翻譯，從而快速高效合成目標蛋白。
該系統沒(méi)有細胞壁，也不必關(guān)注維持活體細胞生命的相關(guān)生化反應，在表達技術(shù)上占據獨特的優(yōu)勢。
同時(shí)，蛋白合成的條件相對容易調整，有助于蛋白的表達和折疊。
依據這一優(yōu)勢，無(wú)細胞蛋白表達體系在生物制藥工程中也較多適用于快速表達醫用蛋白、高通量蛋白庫篩選等復雜蛋白質(zhì)的合成。
該系統的另一個(gè)優(yōu)勢是表達具有毒性的蛋白，由于無(wú)需維持宿主細胞的活性，也更容易地實(shí)現插入非天然氨基酸的表達，可較好地被用于研究蛋白的化學(xué)特性中。
因此，隨著(zhù)近些年來(lái)對該系統相關(guān)應用研究的不斷深入，已經(jīng)逐漸實(shí)現了在生物制藥相關(guān)領(lǐng)域的廣泛應用，如進(jìn)行多肽類(lèi)藥物、腫瘤疫苗、重組蛋白藥物等大規模的生產(chǎn)以及高通量藥物的篩選等。
2.無(wú)細胞蛋白表達體系的分類(lèi)
就目前來(lái)講，已開(kāi)發(fā)出來(lái)的無(wú)細胞蛋白表達系統主要包括原核和真核兩種表達系統類(lèi)型。
兩者由于表達系統的不同，也存在著(zhù)不同的特點(diǎn)，在實(shí)際科學(xué)生產(chǎn)研究的過(guò)程中需要根據不同的需求進(jìn)行兩種表達系統的恰當選擇。
2.1原核系統
對原核表達系統的研究由來(lái)已久，該系統實(shí)現目標蛋白的表達是利用的原核生物細胞提取物，最為常見(jiàn)的是大腸桿菌。
由于其具有較強的耐受性，因此在此基礎上建立無(wú)細胞蛋白表達系統就具有獨特的優(yōu)勢。
人們在具體進(jìn)行目標蛋白的表達中，可以根據需要加入蛋白酶抑制劑以及標記蛋白等特殊添加劑，在含有雜質(zhì)的情況下依舊可以進(jìn)行目標蛋白的表達。
其不足之處在于在進(jìn)行蛋白的翻譯加工后，在正確折疊方面現階段仍是較大的困難。
不過(guò)由于大腸桿菌材料來(lái)源廣泛，成本較低，也存在著(zhù)較高的表達效率，因此在體外表達系統研究中仍是較為熱門(mén)的話(huà)題。
2.2真核系統
真核表達系統是與原核表達相對應的系統，其進(jìn)行目標蛋白的表達，利用的是真核生物細胞提取物。
其中，最為常見(jiàn)的就是麥芽提取物和兔網(wǎng)織紅細胞裂解液。
與上述表達系統不同的是，真核細胞表達系統不存在基因的非特異性激活或者抑制，因此能夠實(shí)現對調控基因的高效表達。
在該表達系統中，為保證得到性質(zhì)相對穩定的蛋白質(zhì)，實(shí)現真核細胞基因組的整合，也常需要將環(huán)狀的模板線(xiàn)性化，以保證合成效率不斷加強。
經(jīng)過(guò)相關(guān)學(xué)者的實(shí)踐研究證實(shí)了，大腸桿菌以及麥芽提取物系統都有著(zhù)較高的合成量，能夠進(jìn)行高通量的蛋白質(zhì)組學(xué)研究。
3.在生物制藥工程中的應用
無(wú)細胞蛋白表達體系長(cháng)時(shí)間以來(lái)由于生產(chǎn)效率低下、成本高昂等缺點(diǎn)的限制，在生物學(xué)領(lǐng)域的研究較廣。
隨著(zhù)生物技術(shù)的進(jìn)步，相關(guān)的能量再生系統以及細胞提取物制備工藝等近些年來(lái)逐漸得以深入的研究和不斷優(yōu)化，實(shí)現了蛋白的體外高通量表達，并有效拓展了無(wú)細胞蛋白表達系統的應用領(lǐng)域。
尤其是在生物制藥領(lǐng)域，該系統有著(zhù)重要的應用潛力，為實(shí)現生物制藥諸多問(wèn)題的解決提供了新的解決思路。
以下是筆者根據自身所學(xué)，總結出的無(wú)細胞蛋白表達系統在生物制藥工程中進(jìn)行重組蛋白藥物的大規模生產(chǎn)、非天然氨基酸的引入以及蛋白的高通量表達等方面的具體應用。
3.1引入非天然氨基酸
進(jìn)行蛋白工程改性的重要途徑就是將非天然氨基酸引入蛋白序列，以為蛋白質(zhì)進(jìn)行化學(xué)修飾提供額外的基因。
在早期的無(wú)細胞蛋白表達體系中，通過(guò)加入抑制性tRNA以識別特定終止密碼子的氨�；�，并以攜帶特定位點(diǎn)無(wú)義突變的基因作為模板，在目標蛋白的特定位點(diǎn)引入非天然氨基酸(見(jiàn)圖2)。
相關(guān)的研究人員在此基礎上發(fā)現了更為有效的編碼非天然氨基酸技術(shù)，并成功實(shí)現了在蛋白藥物進(jìn)行特異性修飾中的應用，賦予了非天然氨基酸以獨特的藥理特性，如延長(cháng)半衰期以及提高了藥代動(dòng)力學(xué)穩定性等。
在現階段的研究中，通過(guò)在無(wú)細胞蛋白表達體系中添加非天然氨基酸底物，建立了高效便捷的反應體系，能夠對目標蛋白進(jìn)行選擇性的修飾。
如國外研究者Zimmerman等現已研發(fā)出新型的抗腫瘤藥物等。
總之，由于這一方面的優(yōu)勢，該體系在升級蛋白藥物領(lǐng)域以及開(kāi)發(fā)新型蛋白藥物中有著(zhù)廣闊的應用前景。
3.2重組蛋白藥物的大規模生產(chǎn)
隨著(zhù)相關(guān)科學(xué)家研究的不斷深入和優(yōu)化，近些年來(lái)無(wú)細胞蛋白表達技術(shù)已日趨成熟，能夠成功開(kāi)發(fā)出反應時(shí)間更長(cháng)、體積更大且生產(chǎn)效率更高的體外蛋白合成系統。
除此以外，無(wú)細胞蛋白表達體系的優(yōu)勢還表現在蛋白活性以及下游純化工藝等方面，推進(jìn)了在重組蛋白藥物生產(chǎn)領(lǐng)域中應用該系統的更深層次的研究和發(fā)展。
無(wú)細胞蛋白表達系統的常用來(lái)源為大腸桿菌，除此以外對上述的真核系統為來(lái)源的表達體系也逐漸被得以進(jìn)一步開(kāi)發(fā)，在更加復雜結構的膜蛋白以及翻譯后的修飾中得以開(kāi)發(fā)生產(chǎn)。
在這一方面國外學(xué)者Brodel等有了新的研究進(jìn)展，其建立了一套新型的哺乳動(dòng)物無(wú)細胞蛋白表達體系，在促進(jìn)蛋白正確折疊、表達復雜蛋白方面占據著(zhù)優(yōu)勢地位。
并且在這一系統下，他們已實(shí)現了在體外進(jìn)行人促紅細胞生成素和螢火蟲(chóng)熒光素酶的成功表達，并實(shí)現了對其進(jìn)行糖基化修飾，有著(zhù)里程碑的研究意義。
其研究結果也證實(shí)了，無(wú)細胞蛋白表達技術(shù)在重組蛋白藥物中，有著(zhù)較好的大規模生�a的應用前景。
3.3蛋白的高通量表達
實(shí)現基因編碼的蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系以及結構功能的系統闡明，成為后基因組時(shí)代科學(xué)家面臨的重大難題之一。
在這一背景下，建立相對高效的高通量蛋白表達技術(shù)就有著(zhù)十分重要的現實(shí)意義。
而無(wú)細胞蛋白表達體系由于其自身獨特的優(yōu)勢，在近些年來(lái)的科學(xué)研究中倍受青睞。
較之傳統的體內表達體系，無(wú)細胞蛋白表達體系省去了對分子的克隆過(guò)程，可直接使用PCR片段作為模板。
對于一些很難在體內進(jìn)行系統表達的復雜蛋白，也能夠實(shí)現在無(wú)細胞蛋白表達系統中的正確折疊。
利用這些優(yōu)勢，研究人員在進(jìn)行體外蛋白質(zhì)組學(xué)的研究過(guò)程中，就有了一個(gè)更加靈活的研究手段。
除此以外，該系統的優(yōu)勢還在于能夠進(jìn)行高效便捷的制備蛋白芯片。
利用無(wú)細胞蛋白表達體系能夠一步法實(shí)現蛋白的固定化，無(wú)需在進(jìn)行大量可溶性蛋白的純化，從而省去了高昂的成本費用以及蛋白的表達與純化過(guò)程，有著(zhù)較為靈活的過(guò)程和特點(diǎn)。
現階段經(jīng)過(guò)大量的實(shí)驗研究，蛋白芯片技術(shù)已逐漸能夠在臨床診斷以及對有毒物質(zhì)的檢測中進(jìn)行有效地應用，如對代謝類(lèi)疾病、癌癥以及免疫的診斷等。
總之，無(wú)細胞蛋白表達體系在蛋白制備技術(shù)以及高通量蛋白表達中的成功應用和快速發(fā)展，也促進(jìn)了其在新藥發(fā)現、疫苗研發(fā)以及疾病診斷等諸多領(lǐng)域的廣泛應用。
綜上所述，作為一種快速高效的體外蛋白合成手段，無(wú)細胞蛋白表達體系較之傳統的體內表達，能夠有效彌補其不足，實(shí)現了復雜蛋白在體外的順利表達，因此在生物制藥領(lǐng)域中有著(zhù)廣闊的應用前景。
當然，在現階段的無(wú)細胞蛋白表達體系中的研究中也仍然存在一定的不足之處，要實(shí)現其在生物制藥工程中更為廣泛的應用，還需要相關(guān)的研究人員不斷優(yōu)化和研究其反應體系，充分挖掘體外合成系統的應用潛力，更好地推進(jìn)我國生物制藥工程的發(fā)展。
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