多酚氧化酶的研究現狀
論文摘要：多酚氧化酶被認為是導致酶促褐變反應的主要因素，對其的研究也在逐步深入。文章結合多酚氧化酶的結構特性、催化機理、活性影響因素、生理功能、活性測定和分離純化等方面的內容，對多酚氧化酶的研究現狀進(jìn)行了綜述。
論文關(guān)鍵詞：多酚氧化酶(PPO);催化機理;生理功能
多酚氧化酶 (polyphenol oxidase，PPO)屬核編碼含銅金屬酶，廣泛存在于植物、真菌、昆蟲(chóng)等機體中。它可分為酪氨酸酶、兒茶酚氧化酶、漆酶等三大類(lèi)，由于其能有效催化多酚類(lèi)化合物氧化形成相應的醌類(lèi)物質(zhì)，因此被認為是導致酶促褐變反應的主要因素。早在1937年Kubowitz就在Warburg實(shí)驗室中第一次分離得到了多酚氧化酶[2，3]。隨著(zhù)研究的不斷深入，對多酚氧化酶各方面的認識也在不斷加深，本文就多酚氧化酶的結構特性、催化機理、生理作用等方面做簡(jiǎn)要的介紹。
一、多酚氧化酶PPO的結構特性
PPO是一種含有Cu2+離子的結構蛋白，可以催化酚類(lèi)上的羥基，使之轉化為醌或催化多酚類(lèi)變?yōu)檠鹾?a href="http://www.xianruitang.com/pic/zi/8689.html" target="_blank" title="醌">醌。因為醌類(lèi)具有較強的電化學(xué)性質(zhì)，會(huì )發(fā)生自動(dòng)氧化、蛋白質(zhì)的親核聚合反應及一些二級反應，而這些反應都會(huì )導致酶促褐變反應的發(fā)生。植物中的PPO包括一些由核編碼的，多基因的家族。在蕃茄中，已有幾個(gè)PPO的基因被分離出來(lái)，并從結構上將其分為三組。在馬鈴薯中，有4條獨立的cDNA被克隆，每一個(gè)都顯示了獨特的空間圖景。在扁豆中，有三條與PPO有關(guān)的cDNA克隆已被建立。所有的PPO基因都有兩個(gè)區域，一是與Cu有關(guān)的編碼區，另一個(gè)是引導肽(transitpeptide)，以便能進(jìn)入質(zhì)體。PPO的前體(含有引導肽的)約60-75KDa，而成熟的PPO(去除了引導肽的有活性的形式)約45-69 KDa，由于這種潛在的酶活性的存在，使PPO活性的問(wèn)題研究起來(lái)十分復雜。未激活的PPO可被陳化作用、加鹽、去污劑(如SDS)、蛋白酶切或尿素的加入等激活。
二、PPO的催化機理
多酚氧化酶(PolyphenolOxidase，PPO)是從真菌到植物乃至哺乳動(dòng)物體內都廣泛存在的一類(lèi)銅蛋白，它能有效催化多酚類(lèi)化合物氧化形成相應的醒類(lèi)物質(zhì)。在茶兒茶素氧化PPO底物兒茶素(catechin)類(lèi)能和許多金屬離子絡(luò )合，Cu2+離子形成的配位物中的配位數為4或6，可以從配位體的配位鍵來(lái)闡明PPO的催化生化機理。PPO的多肽鏈通過(guò)自身的折疊卷曲，形成具有一定構象的高級結構。Cu2+與多肽鏈上的氨基酸殘基以配位鍵相連，主要有His-His和Cys-His殘基作為銅離子的配基，形成具有特定立體結構的活性部位。當鄰苯二酚基和底物存在時(shí)，由于其“靠近”及“定向”效應，使多肽鏈和底物的空間構象發(fā)生改變，相互契合，從而使底物進(jìn)入活性中心，鄰苯二酚基上的二個(gè)羥基與多肽鏈上的氨基酸殘基以氫鍵相連，形成酶與底物的復合物，由于復合物的不穩定性，多肽鏈構象發(fā)生扭曲，氫鍵斷裂，H被附著(zhù)在多肽鏈上，酶與底物不再契合，兩者都同時(shí)發(fā)生構象轉變，于是產(chǎn)物脫離了活性部位，成為鄰醌。鄰醌可發(fā)生一系列次生氧化作用，形成了多種氧化產(chǎn)物。酶又通過(guò)脫氫作用，發(fā)生構象回轉，恢復以前的天然構象，重新成為具有催化能力的蛋白質(zhì)。
三、PPO的生理功能
高等植物組織發(fā)生褐變主要是PPO活動(dòng)的結果。PPO催化單酚羥基化為鄰二酚，二羥酚氧化為鄰醌。醌聚合并與細胞內蛋白質(zhì)的氨基酸反應，結果發(fā)生黑色或褐色色素沉淀，最終導致水果、蔬菜等經(jīng)濟作物營(yíng)養丟失和經(jīng)濟損失。
PPO作為一種氧化還原酶還在光合作用中發(fā)揮作用。如調節葉綠體中有害的光氧化反應速度，參與其中電子傳遞;PPO還可促進(jìn)傷口的愈合，也可增加植物對病原體的抗性。如煙草對炭疽病、黃瓜對黑星病、蘋(píng)果對輪紋病、棉苗對枯萎病菌、水稻對白葉枯病菌和細菌性條斑病以及番茄對小昆蟲(chóng)的抗性等。PPO的作用方式有：
1.如番茄的具腺毛狀體中含有大量PPO，PPO具有存在于表皮中、活化態(tài)和可溶性的特性，在毛狀體介導的抗病過(guò)程中起作用[12]。
2.通過(guò)醌共價(jià)調節親核氨基酸形成抗營(yíng)養機制，直接抵御昆蟲(chóng)和病原體[13]。
3.醌的毒性直接發(fā)揮抗病作用。
4.如番茄中PPO克隆的反義表達可對基因家族的各成員進(jìn)行負調節，對病原體產(chǎn)生超敏感性(感受性過(guò)敏)[14]。
5.鄰醌的次生反應所產(chǎn)生的黑色素的痂可阻止感染的擴散[15]。
PPO與水果和作物的褐變有關(guān)，為了防止水果褐變保持水果的新鮮性，生產(chǎn)上運用多種方法來(lái)降低水果中的PPO含量，例如涂以抗壞血酸、檸檬酸為主劑的復合護色劑，杏用沸水燙4min基本控制PPO活性，對萊陽(yáng)梨進(jìn)行套袋抑制PPO活性等。
四、PPO活性影響因素
隨著(zhù)誘導劑特性的不同，PPO的分子特性如分子量、等電點(diǎn)等都有所改變。生長(cháng)培養基的成分也可部分地控制PPO酶產(chǎn)量，例如：硫酸銨抑制PPO形成，而谷氨酸促進(jìn)PPO形成。在植物組織中激活劑可打破PPO的潛伏狀態(tài)。在蠶豆中PPO可被游離脂肪酸酸化激活，菠菜類(lèi)囊體中分離出來(lái)的PPO可被亞麻酸激活。這表明PPO的天然激活劑確實(shí)存在。同樣PPO的天然抑制劑也存在，例如菠菜葉中的草酸鹽，茶葉中的橡黃素、白花青素等。礦物質(zhì)營(yíng)養例如鈣或磷的缺乏可導致PPO活性的降低;硼缺乏對單子葉植物無(wú)影響，但可導致雙子葉植物中PPO活性的增加。植物正常新陳代謝受到干擾也會(huì )導致PPO活性的改變：例如貯存時(shí)通風(fēng)不好或生長(cháng)時(shí)水分不夠均可引起PPO水平的升高。銅是PPO的組成部分，銅缺失時(shí)苜蓿葉片不能表現出PPO酶活性，即使后來(lái)再補充銅也不行，這說(shuō)明全酶只能在發(fā)育的早期形成。
鐘瑾等[16]用自制殼聚糖與戊二醛交聯(lián)對PPO固定化進(jìn)行了初步探討，表明當戊二醛濃度為2%時(shí)，酶活力最高，并提出在確定給酶量時(shí)，要兼顧酶活和回收率二者的影響以達到最佳。李榮林等[17]應用海藻酸鈉和戊二醛交聯(lián)法對PPO進(jìn)行包埋取得了成功，并對其性質(zhì)進(jìn)行了系統研究發(fā)現[18]：將酶的最適pH上移至7.0，最適溫度上升至40℃，酶對金屬離子的適應性增強，對抑制劑敏感性下降，低溫貯存下，半衰期由3個(gè)月上升到221天。
五、PPO活性的測定方法
測定多酚氧化酶活性的方法有：檢壓法、極譜電極法、比色法、碘量滴定法等[19]。最早是將酚或鄰苯二酚作為底物用滴定法來(lái)測定多酚氧化酶活性，后來(lái)發(fā)現用極譜電極法測定O2消耗更精確一些[20]。但是，無(wú)論是滴定法還是極譜電極法都必須經(jīng)過(guò)種子研磨的過(guò)程，為了測定的省時(shí)方便， Kruger[21]首創(chuàng )了無(wú)須研磨種子就可以測出小麥多酚氧化酶活性的方法:種子在水中浸泡16h，然后加入鄰苯二酚，反應30min后用動(dòng)態(tài)的微盤(pán)計數器測溶液的顏色變化。將這種方法與研磨種子氧電極法比較，相關(guān)系數為0. 85。伴隨著(zhù)科技的發(fā)展和分光光度計的應用， Anderson[22]將整粒種子測定方法做了進(jìn)一步改進(jìn): 3～5個(gè)整籽�；�0.4g被鉗碎的種子放入離心管中，加入用50mM MOPS緩沖液配制的L-DO-PA，室溫振蕩反應30min或37℃振搖5min后過(guò)濾，然后在分光光度計下測定475nm吸收值，這種方法與研磨種子氧電極法比較，相關(guān)系數為0.86。
六、PPO的分離純化
PPO通常以不溶狀態(tài)存在，為使其以可溶形式從完整細胞或組織結構中釋放出來(lái)，并保持其活性和穩定性，通常要進(jìn)行充分的細胞破碎，釋放出細胞的內含物，經(jīng)勻漿提取后可得粗酶制劑。為了減少對細胞活動(dòng)的影響，需盡量去模擬細胞體內的環(huán)境，如適宜的pH(5.6)、溫度(37℃)等。如茶葉中存在大量的多酚類(lèi)物質(zhì)，因此在該酶的分離提純過(guò)程中要加入多酚吸附劑，如聚乙烯基吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone，PVP)等以清除多酚。
多酚氧化酶的分離提純方法有冷丙酮法和勻漿法二種方法。須海榮 [23]研究指出：冷丙酮法效果較差，酶活較低，可能跟丙酮引起酶蛋白不可逆變性有關(guān)，但其操作相對而言較為方便。隨著(zhù)酶提取技術(shù)的發(fā)展，勻漿法逐步得以完善，首先它在酶的提取過(guò)程中能最大限度地保留酶的活性，其次能去除多酚氧化酶提取中的一些雜蛋白以及過(guò)氧化物酶等一些酶蛋白的影響。再采取硫酸銨分級沉淀，凝膠色譜等技術(shù)，以達到純化目的。
七、應用前景
調節PPO表達是未來(lái)研究熱點(diǎn)，一方面因為受傷或衰老會(huì )導致黑色素的形成，負調節PPO能大量提高作物的質(zhì)量;另一方面PPO的過(guò)度表達能減少害蟲(chóng)對作物的侵害，或通過(guò)影響植物蛋白形成抗營(yíng)養機制，或在毛狀體滲出液中通過(guò)它啟動(dòng)聚合作用捕獲昆蟲(chóng)。因此負調節PPO表達或調節PPO使其過(guò)度表達在生產(chǎn)及應用方面都具有很好的前景及重要的實(shí)際意義。
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