對遺傳學(xué)診斷的分析論文

　　近二十年來(lái)，分子遺傳學(xué)的一系列成就，不僅推動(dòng)了分子生物學(xué)和基礎醫學(xué)的發(fā)展，而且對遺傳疾病的診斷和治療，也應用了分子遺傳學(xué)的新技術(shù)如分子雜交、內切酶、DNA重組等進(jìn)行了探索，并獲得了有意義的結果。生物遺傳的基本單位是基因，其遺傳信息貯存在DNA(去氧核糖核酸)分子的堿基序列之中。結構基因就是決定特殊蛋白質(zhì)遺傳密碼的DNA的一個(gè)片段。

　　一、運用單細胞雙重巢式PCR和MDA技術(shù)方法行性連鎖遺傳病診斷

　　1、提取男女單個(gè)淋巴細胞各150例，共300個(gè)細胞。隨機分成3組，每組男女細胞各50個(gè)，雙重巢式PCR技術(shù)在單細胞水平同時(shí)擴增 X-類(lèi)固醇硫酸脂酶基因(steroid sulfatase gene， STS)/Y-假基因和牙釉質(zhì)基因(Amelogenin，AMEL)，對照組用單重巢式PCR技術(shù)在單細胞水平分別擴增兩基因，比較單、雙重巢式PCR 技術(shù)在單細胞水平的擴增率及性別診斷正確率。

　　2、應用MDA擴增5個(gè)單個(gè)淋巴細胞和10個(gè)單個(gè)卵裂球全基因組DNA，1%的瓊脂糖電泳檢測擴增效率，通過(guò)普通PCR即上述巢式PCR的第二輪的PCR條件檢測細胞性別來(lái)判斷擴增產(chǎn)物的均一性。結果1、單重巢式PCR擴增男性細胞STS和AMEL的擴增率和細胞性別診斷的正確率分別是84%、76%和84%、84%;而雙重巢式PCR技術(shù)同時(shí)擴增上述基因的擴增率和性別診斷正確率分別為98%、96%。后者與前兩者相比擴增率和性別診斷正確率均明顯提高，差異均有統計學(xué)意義(P<0.05、P<0.01)。

　　3、MDA擴增5個(gè)淋巴細胞(3個(gè)為男性細胞，2個(gè)為女性細胞)全部擴增成功，擴增率100%;MDA擴增10個(gè)卵裂球有4個(gè)擴出產(chǎn)物，擴增率為40%。以MDA產(chǎn)物為模板，用STS的第二輪引物檢測單個(gè)淋巴細胞性別，正確性為100%;檢測所有擴出產(chǎn)物的卵裂球也均能檢測出性別，發(fā)現2個(gè)為男性，2個(gè)為女性，可惜的是這4個(gè)卵裂球均來(lái)自不同的胚胎，所以不能相互驗證。從淋巴細胞MDA產(chǎn)物檢測的結果可以判斷MDA產(chǎn)物也是均一的。結論1、在單細胞水平性連鎖遺傳疾病診斷中，雙重巢式PCR技術(shù)較單重巢式PCR技術(shù)具有較高的擴增率及診斷正確率，并有助于發(fā)現等位基因脫扣(allele dropout， ADO)。該法在無(wú)創(chuàng )性單基因伴性遺傳病的產(chǎn)前診斷和植入前遺傳學(xué)診斷中具有較高的實(shí)際應用價(jià)值，且經(jīng)濟、便捷，值得臨床進(jìn)一步推廣。

　　4、初步預實(shí)驗可知 MDA可以克服單細胞的模板量少和不可重復實(shí)驗的缺點(diǎn)。但由于此次預實(shí)驗的樣本量太小，其穩定性、可靠性還需進(jìn)一步摸索，才可以用于單基因病的著(zhù)床前遺傳學(xué)診斷和產(chǎn)前診斷。

　　二、利用孕婦外周血漿中小片段游離胎兒DNA進(jìn)行無(wú)創(chuàng )性地中海貧血產(chǎn)前基因診斷的研究

　　方法：收集157例孕婦的外周血，利用柱吸收的方法提取血漿中的cffDNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離富集小片段cffDNA，使用二重PCR 反應(dulex-PCR)檢測SRY基因和磷酸甘油醛脫氫酶(glycerol-dehyde- phosphatedehydrogenase，GAPDH)基因。結果來(lái)源于86例孕男胎的孕婦血漿標本的小片段cffDNA均檢出SRY和GAPDH 基因，來(lái)源于71例孕女胎的孕婦血漿標本的小片段cffDNA只檢出GAPDH基因。與絨毛/羊水標本檢測結果以及產(chǎn)后隨訪(fǎng)結果相符。特異性和敏感性分別為100%(157/157)和100%(86/86)。結論利用瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收，可以選擇性富集孕婦外周血中的小片段cffDNA，相對地提高胎兒DNA的含量，結合二重PCR擴增SRY基因技術(shù)可用于無(wú)創(chuàng )性產(chǎn)前性連鎖遺傳疾病和單基因突變疾病的產(chǎn)前診斷。第二部分利用孕婦外周血漿中 cffDNA進(jìn)行STR-PCR檢測胎兒基因型目的：利用小片段cffDNA進(jìn)行D5S818、D7S820、D13S317三個(gè)短串聯(lián)重復序列(short tandem repeat，STR)基因型的分析，觀(guān)察提取出來(lái)的小片段cffDNA中母源性DNA背景對實(shí)驗的影響。

　　方法：收集了62例孕婦外周血標本，提取小片段游離胎兒DNA，利用多重PCR(mutilplex-PCR)的方法分析胎兒的STR基因型，并與父母基因型相比對。結果：62例小片段cffDNA的擴增結果中，49例標本的擴增結果完全與父母基因型相匹配，未發(fā)現母源性DNA的污染。其余13例在D13S317基因座的擴增中出現了母源性DNA的污染。

　　結論：經(jīng)過(guò)對小片段cffDNA進(jìn)行富集后，仍有可能出現母源性DNA對實(shí)驗的影響，并且可能影響對實(shí)驗結果的判讀。使用多重PCR反應結合多基因座的擴增，可能可以有助于減少母源性DNA的影響，有助于結果的判讀。第三部分利用孕婦外周血漿中小片段游離胎兒DNA進(jìn)行β-地中海貧血無(wú)創(chuàng )性產(chǎn)前基因診斷目的：利用cffDNA對胎兒進(jìn)行廣西、廣東地區常見(jiàn)的17種β-地中海貧血基因型的檢測，與傳統創(chuàng )傷性產(chǎn)前診斷相比較，探討該方法的準確性和可行性。方法：針對廣西、廣東地區常見(jiàn)的β-地中海貧血突變的基因型設計三對不同引物，并用生物素標記。對cffDNA進(jìn)行二次PCR反應后，使用反向斑點(diǎn)雜交(revert dot-blot hybridization，RDB)檢測胎兒的β-珠蛋白基因型，與創(chuàng )傷性產(chǎn)前診斷結果比較，觀(guān)察準確率。

　　結果：37例cffDNA標本檢測中，檢出重型β-地中海貧血19例，輕型β-地中海貧血11例，正常7例，與創(chuàng )傷性產(chǎn)前診斷結果相比較出現3例誤診，準確率為91.9%(34/37)。結論：利用 cffDNA進(jìn)行β-地中海貧血的檢測，可能出現母源性DNA背景的污染，當胎兒基因型與母親基因型相同時(shí)，必須提高警惕，進(jìn)一步分析或者復查。因為該技術(shù)取樣容易，對孕婦胎兒無(wú)風(fēng)險，不受孕期時(shí)間影響，易為與孕婦接受，因此進(jìn)一步改進(jìn)該技術(shù)后有望可用于β-地中海貧血的診斷。第四部分利用孕婦外周血漿中小片段游離胎兒DNA進(jìn)行巴氏水腫胎兒檢測目的：通過(guò)檢測cffDNA以及母源性cfDNA在PCR反應中擴增效率的不同，進(jìn)行檢測巴氏水腫胎兒(Hb Bart’s hydrops foetus)的方法學(xué)研究。方法：對來(lái)源于擬診孕水腫胎兒孕婦的小片段cffDNA，進(jìn)行熒光PCR(Fluorescence PCR)擴增，利用毛細管電泳(capillary electrophoresis，CE)技術(shù)判斷兩種產(chǎn)物峰面積比(peak area ratio)來(lái)檢測巴氏水腫胎兒。結果：30例擬診巴氏水腫胎兒的小片段cffDNA擴增結果提示，巴氏水腫胎兒兩種產(chǎn)物鋒面積比遠遠<1。而其他原因所致的水腫胎兒的cffDNA模板擴增結果顯示兩種產(chǎn)物封面值比近似等于1。

　　結論：

　　通過(guò)熒光PCR和毛細管電泳的方法，有望利用cffDNA進(jìn)行巴氏水腫胎兒的無(wú)創(chuàng )性產(chǎn)前診斷。

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