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鼠源抗柑橘潰瘍病菌Fab抗體庫的構建
1 引言
柑桔潰瘍病是由地毯草黃單胞桿菌柑桔致病變種( Xanthomonas axonopodis pv. citri) 引起的一種國內外重大檢疫性病害，給世界柑桔產(chǎn)業(yè)帶來(lái)了巨大經(jīng)濟損失。病菌主要隨罹病種苗等繁殖材料遠距離傳播，生產(chǎn)上常用的銅基殺菌劑和抗生素制劑對其防效不佳[1]，探索柑桔潰瘍病的防治新途徑在目前和將來(lái)都具有重大意義�；蚬こ讨亟M單抗兼具治療和診斷雙重功能，利用抗原-抗體特異性結合原理，可用于人類(lèi)疾病、植物病害的診斷、治療和預防。
近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的噬菌體抗體庫技術(shù)使人們可以繞開(kāi)細胞雜交瘤技術(shù)，直接從基因水平制備特異性單鏈抗體，由此開(kāi)創(chuàng )了簡(jiǎn)便、快速生產(chǎn)基因工程抗體的先河，被認為是繼雜交瘤技術(shù)后抗體生產(chǎn)技術(shù)的又一次革命[2,3]。20 世紀80 年代中期，Smith[4] 等提出了噬菌體展示技術(shù)，到90 年代初，Winter 等在前人的研究基礎上創(chuàng )建了噬菌體抗體庫技術(shù)，將噬菌體展示技術(shù)應用到抗體工程領(lǐng)域，徹底改變了制備抗體的傳統途徑，使抗體技術(shù)進(jìn)入到了基因工程抗體時(shí)代。近年來(lái)噬菌體抗體庫技術(shù)已經(jīng)成功應用于醫學(xué)研究及疾病診斷方面，但應用在植物病害方面研究的報道卻寥寥無(wú)幾[5,6]。Fab 抗體是由抗體輕鏈片段及重鏈的Fd 段組成的，與單鏈抗體ScFv 相比，具有穩定性更好的特點(diǎn)，且可直接在大腸桿菌中表達有活性的抗體，制備簡(jiǎn)單，省去了復性等繁瑣的步驟。本研究采用噬菌體抗體庫技術(shù)，以經(jīng)過(guò)多次免疫的小鼠脾細胞mRNA 為基礎，擴增出抗體輕鏈及重鏈Fd 段分別連接到噬粒載體中構建噬菌體抗體庫，為后面的研究奠定基礎。
2 材料與方法
2.1 材料
2.1.1 實(shí)驗動(dòng)物
6～8 周齡BALB/c 小鼠4 只，均購自第三軍醫大。
2.1.2 菌株及載體
噬粒 pComb3XSS 由美國B(niǎo)arbas 實(shí)驗室饋贈；Top10 F’、輔助噬菌體VCSM13 為本中心保存；大腸桿菌(Escherichia coli)XL1-Blue 由重慶工學(xué)院饋贈。
2.1.3 試劑及耗材
TRIZOL 購自Invitrogen 公司；M-MLV 反轉錄酶購自Promega 公司；限制性?xún)惹忻窼acⅠ、XbaⅠ、SpeⅠ、XhoⅠ及T4 DNA 連接酶均購自NEB 公司；其它試劑為國產(chǎn)分析純。
2.1.4 引物
參照美國 Scipps 研究所鼠源抗體庫構建的引物及《實(shí)用分子生物學(xué)操作指南》[7]設計簡(jiǎn)并引物，由上海生工合成。
2.2 方法
2.2.1 動(dòng)物免疫
將柑桔潰瘍菌用生理鹽水稀釋至 1×108CFU/ml，取0.5 ml 腹腔注射6～8 周齡BALB/c小鼠，每周免疫一次，免疫4 周后用ELISA 法測血清效價(jià)，加強免疫3 天后取脾，并用無(wú)菌注射器針柄在200 目的不銹鋼濾網(wǎng)中將脾臟分離成單個(gè)細胞，加入Eppendorf 中，離心去上清，用液氮速凍后70℃保存。
2.2.2 提取RNA 及cDNA 第一鏈擴增
按照 Trizol 試劑盒說(shuō)明書(shū)提取小鼠脾臟RNA，通過(guò)凝膠電泳及測OD 值確定RNA 的質(zhì)量。以Oligo-dT 為引物反轉錄合成cDNA 第一鏈。
2.2.3 PCR 擴增輕鏈及重鏈Fd 段基因
通過(guò)溫度梯度摸索 PCR 反應條件為94℃ 50s，57℃ 50s，72℃ 10min，35 個(gè)循環(huán)，PCR產(chǎn)物在1.5 %瓊脂糖凝膠電泳驗證, 采用凝膠DNA 回收試劑盒回收PCR 產(chǎn)物。
2.2.4 鼠源抗柑橘潰瘍病菌Fab 抗體庫的構建
將 κ 鏈基因 PCR 產(chǎn)物與 pComb3xss 分別用 SacⅠ/XbaⅠ消化，經(jīng)瓊脂糖電泳分離并純化回收, 取1.0 μg 載體片段與0.2 μg κ 鏈片段在80 μL T4 DNA 連接酶反應體系中進(jìn)行連接反應, 經(jīng)沉淀回收后電擊轉化XL1- Blue 感受態(tài)細菌, 加入2 mL SOC，37℃、250rpm 培養1 h 后取少量鋪盤(pán)測定, 其余加入100 mL 含50 μg /mL 氨芐青霉素和10 μg/mL 四環(huán)素的 SB 培養液中培養過(guò)夜。提取質(zhì)粒, 得到輕鏈庫。再分別將輕鏈庫與Fd 段用 SpeⅠ/XhoⅠ酶切后回收，按前法進(jìn)行連接、轉化、細菌擴增及轉化子測定。在加入100mL SB 培養液1 h 后加入1 mL 約1012 pfu 的輔助噬菌體 VCSM 13，再培養2 h 后，加卡那霉素至70 μg/mL，37 ℃振蕩過(guò)夜。次日離心收集上清, 加 PEG8000 至4%、NaCl 至3%,冰浴30min，4℃、9 000 r /min 離心20 min, 棄上清, 用2 mL 1%的BSA- PBS 溶解沉淀, 12000 r /min 離心5 min, 棄去不溶性沉淀, 所得上清即為 Fab 噬菌體抗體庫。
2.2.5 陽(yáng)性克隆的菌落PCR 鑒定及酶切鑒定
分別挑取 10 個(gè)輕鏈庫及 Fab 庫陽(yáng)性克隆，經(jīng) PCR 初步鑒定后再分別用 SacⅠ/XbaⅠ及 SpeⅠ/XhoⅠ 雙酶切鑒定其重組率。
3. 結果與分析
3.1 總RNA 的提取
對提取的總RNA 進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，其中總RNA 電泳條帶以28S rRNA 和18SrRNA 為主，用分光光度計測得總RNA 的OD260 / OD280 的比值為1. 8，濃度約為1μg/μL，顯示總RNA 質(zhì)量好，無(wú)降解，符合試驗的要求。
3.2 輕鏈和重鏈Fd 段基因的擴增
以 cDNA 第一鏈為模板，分別以輕鏈和重鏈Fd 段基因的3′端引物和5′端引物進(jìn)行PCR 反應，分別擴增出輕鏈和Fd 段。將PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，顯示在約680 bp 處可見(jiàn)明顯的擴增條帶(如圖2)，與理論值相符。M 為DNA 分子量標準MarkerⅡ, 1-7 分別為輕鏈基因的PCR 產(chǎn)物，8-10 分別為重鏈基因的PCR 產(chǎn)物。
3.3 輕鏈基因庫的構建
1μL 輕鏈重組噬粒的轉化細菌菌液鋪板克隆數為 1009 個(gè)，測定轉化效率為1×106，通過(guò)菌落PCR 法鑒定輕鏈重組質(zhì)粒，電泳結果顯示 10 個(gè)克隆在680 bp 處都有條帶，均判定為陽(yáng)性克隆，用SacI 和XbaI 對重組噬粒進(jìn)行酶切反應再次驗證，酶切后產(chǎn)物電泳發(fā)現10 個(gè)克隆均有約4 kb + 680 bp 兩個(gè)條帶，判定為陽(yáng)性克隆(如圖3)，由此計算重組率約為100%。
3.4 噬菌體Fab 抗體庫的構建
1μL 含抗體Fab 片段基因的重組噬粒轉化細菌菌液鋪板有2006 個(gè)克隆子，計算出轉化率約為2×106。隨機挑取10 個(gè)轉化后的克隆子，通過(guò)菌落PCR 法鑒定，其中有8 個(gè)菌落擴增出680 bp 的片段，判定為陽(yáng)性克隆，用XhoI 和SpeI 對重組噬粒進(jìn)行酶切反應再次驗證，酶切后產(chǎn)物電泳發(fā)現8 個(gè)陽(yáng)性克隆均切出4 kb + 680 bp 兩個(gè)條帶，判定為陽(yáng)性克�。ㄈ鐖D 4），由此計算重組率約為80%，庫容量為1.6 ×106。經(jīng)過(guò)輔助噬菌體VCSM13 的超感染，在PEG 沉淀濃縮后，得到的上清即是噬菌體抗體庫，測得噬菌體抗體庫滴度為2.4×1011 cfu。
4 討論
隨著(zhù)基因工程的不斷發(fā)展，一些小分子抗體在疾病的診斷治療方面越來(lái)越受到重視。但是在植物病害方面的應用卻比較少，目前本實(shí)驗室已經(jīng)得到了抗柑桔潰瘍病菌親和力較高的ScFv抗體[8]，但由于其穩定性不夠，影響了實(shí)際應用，相比之下Fab抗體彌補了這一不足[9]。
在本研究中采用柑桔潰瘍病菌免疫的小鼠為建庫源，從理論上來(lái)說(shuō)，已包含抗柑桔潰瘍病菌的各種抗體基因，而且在構建噬菌體抗體庫時(shí)，抗體重鏈基因和輕鏈基因之間的隨機組合進(jìn)一步豐富了抗體對抗原識別的多樣性。 有研究表明，107個(gè)特異性抗體分子就能識別全部抗原決定簇的99%， 構建一個(gè)庫容為108 的組合噬菌體抗體庫，一般可以認為基本上包括了所有的抗體分子。目前所構建的各類(lèi)抗體庫，庫容一般介于106-108[10]，我們構建的抗體庫，庫容為1.6×106，滴度為2.4×1011 cfu，基本達到建庫要求，能滿(mǎn)足多樣性的要求[11]。在以pComb3XSS為載體的噬菌體展示系統中，克隆位點(diǎn)下游含有有一個(gè)能夠編碼6個(gè)組氨酸的His-tag 序列，該序列可作為蛋白標簽來(lái)進(jìn)行目的蛋白的檢測和純化，還含有一個(gè)琥珀終止子，在非琥珀抑制型的大腸桿菌中只表達目的蛋白，為后期的純化工作帶來(lái)方便。
構建過(guò)程中的諸多環(huán)節都可影響抗體庫的質(zhì)量，載體的轉化效率是制約抗體庫容量和豐富性的重要因素之一。一般研究中都采用電穿孔法將重組DNA轉入宿主菌， 其轉化效率最高可達109-1010轉化子/μg DNA，但是如果在培養液中使用抗生素，電穿孔的轉化效率會(huì )顯著(zhù)降低3-5個(gè)數量級。本研究中我們制備了超級感受態(tài)進(jìn)行化學(xué)轉化，運用該方法一般情況下可以獲得2×108或者更高的轉化效率，比常規的CaCl2轉化法要高出2-3個(gè)數量級。在我們的實(shí)際應用兩次轉化中獲得了106-107的較好轉化效率，且轉化的結果比較穩定�？贵w基因的擴增是影響庫容量的另一個(gè)重要因素，其中輕鏈比較容易擴增，在56-58℃均可擴增出比較亮的目的條帶，但是重鏈Fd段的擴增相對困難一些，而且產(chǎn)率也沒(méi)有輕鏈基因的高，這可能與重鏈基因相對復雜有著(zhù)重要關(guān)系。在克隆過(guò)程中，為盡量減少對重鏈基因的操作，增加抗體庫的多樣性，采用先連接輕鏈基因，后連接重鏈Fd段。
5 結論
本研究成功構建了滴度為2.4×1011 cfu 的鼠源抗柑桔潰瘍病菌噬菌體Fab 抗體庫，為進(jìn)一步研究柑桔潰瘍病的防治工作奠定了堅實(shí)的基礎。
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