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基于熒光成像的生命科學(xué)論文
1.激光共聚焦顯微鏡
激光共聚焦顯微鏡在傳統光學(xué)顯微鏡的基礎上作了改進(jìn)，具有除目鏡與物鏡之外的圖片放大功能，可以隨時(shí)采集和記錄檢測信號，觀(guān)察活細胞的結構及特定分子、離子的生物學(xué)變化。其選擇單色性較好的激光作為光源，從根本上消除了色差。物鏡的焦平面上加了一個(gè)帶孔擋板，阻擋了焦平面外的雜散光，進(jìn)一步消除色差。樣品被分解成二維或三維空間上的無(wú)數個(gè)點(diǎn)，激光束逐個(gè)掃描成像，進(jìn)而組成整體的平面或立體圖像，計算機代替肉眼或照相機進(jìn)行觀(guān)察或攝像，數字化的圖像在電腦中進(jìn)一步處理，提高了圖像的清晰度。該儀器還使用了光電倍增管，將微弱的信號放大，大大提高了靈敏度。由于以上優(yōu)點(diǎn)，激光共聚焦顯微鏡可以應用到幾乎所有有關(guān)細胞研究的領(lǐng)域。如原位鑒定細胞或組織內的生物大分子，觀(guān)察細胞或亞細胞的形態(tài)結構；無(wú)損傷實(shí)時(shí)檢測分析活細胞，并研究其形態(tài)和功能；在一個(gè)樣品上同時(shí)進(jìn)行多重標記，實(shí)時(shí)觀(guān)察等。
2熒光探針
熒光探針在熒光成像技術(shù)中占據舉足輕重的地位。一般熒光探針需具備優(yōu)良的光物理性質(zhì)，以便于激發(fā)和檢測，且不與生物基質(zhì)同時(shí)被激發(fā)，還要有較高的熒光量子產(chǎn)率和摩爾消光系數。熒光探針的溶解度要大，便于溶于緩沖液或細胞培養液中，且熱、光性質(zhì)比較穩定，有特異性標記位點(diǎn)。熒光探針需要具有良好的生物相容性，易于進(jìn)入細胞內。熒光探針大致分為兩類(lèi)，包括化學(xué)類(lèi)和生物類(lèi)�；瘜W(xué)類(lèi)包括有機染料、納米材料（金納米粒子、半導體量子點(diǎn)等）及金屬配合物等。生物類(lèi)包括藻膽蛋白、分子燈標及基因編碼熒光蛋白等。熒光探針在化學(xué)、光學(xué)、生物學(xué)等領(lǐng)域應用廣泛，但是，目前仍缺少有效的分子探針識別疾病分子水平上的獨特位點(diǎn)，故從分子水平上進(jìn)行病理研究比較困難。
3熒光成像技術(shù)的應用
3.1蛋白質(zhì)、金屬離子的檢測
生物體的生理狀態(tài)可以通過(guò)蛋白質(zhì)表現出來(lái)，生命活動(dòng)離不開(kāi)各種酶的作用，而酶大多是由蛋白質(zhì)構成的，故研究蛋白質(zhì)的結構和功能在認識生命活動(dòng)過(guò)程中至關(guān)重要。劉亭延等采用熒光成像技術(shù)構建了一種檢測人血清蛋白質(zhì)的新方法。該方法以碳量子點(diǎn)為標記染料，以聚丙烯酰胺凝膠電泳分離出人血清蛋白，優(yōu)化實(shí)驗條件，最終得到清晰的電泳圖。段相國等建立了一種ＨＣＶＮＳ３／４Ａ蛋白酶在小鼠體內瞬間表達的模型。金屬離子在生物學(xué)中起重要作用，金屬離子與熒光探針結合，在熒光顯微鏡下可觀(guān)察細胞內金屬離子的變化。Ｍｉｃｈａｅｌ等選用Ｉｎｄｏ－１為模板，合成了一系列檢測Ｃａ２＋的熒光探針，可用于確定活細胞中特定位置的Ｃａ２＋濃度。Ｓａｒｅ等合成了Ｚｎ２＋的熒光探針，并應用到細胞中Ｚｎ２＋的檢測識別中。人們還建立了Ｍｇ、Ｃｕ、Ｈｇ、Ｃｄ等離子的檢測模型。熒光成像技術(shù)應用于蛋白質(zhì)及細胞內金屬離子檢測還存在一些問(wèn)題，如有的熒光探針不能通過(guò)細胞膜、成像過(guò)程對細胞造成損害、檢測方法不統一等，因此，建立統一、低損害的熒光成像檢測技術(shù)仍是極具挑戰性的研究課題。
3.2腫瘤疾病的檢測和診斷
目前，腫瘤的臨床診斷主要依賴(lài)于顯微形態(tài)學(xué)觀(guān)察，從而在細胞層面上了解腫瘤細胞的類(lèi)型與個(gè)體差異，這就要求檢測手段不斷進(jìn)步。熒光成像技術(shù)以其操作方便、標記靶點(diǎn)多、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應用于腫瘤跟蹤成像研究中，具有廣闊的臨床應用價(jià)值。高苒等建立了一種小鼠腫瘤模型，利用熒光顯微鏡和活體熒光成像儀可直接從整體和細胞水平上觀(guān)察腫瘤，了解宿主與腫瘤間的作用。至今為止，人們對此進(jìn)行了深入的探討和研究，但該技術(shù)應用于體內時(shí)需要考慮復雜的體內環(huán)境，動(dòng)物組織會(huì )產(chǎn)生背景噪音，影響該技術(shù)的發(fā)展應用。
3.3藥物新劑型研究
為了提高藥物療效，降低毒副作用，發(fā)展藥物新劑型尤為重要。熒光探針的不斷發(fā)展使熒光成像技術(shù)在這一領(lǐng)域的應用范圍不斷擴大，可用于對藥物運輸過(guò)程、細胞屏障跨越方式、藥物釋放過(guò)程等的觀(guān)測研究，它的迅速發(fā)展也大大促進(jìn)了藥物新劑型研究的迅速發(fā)展。陳剛等研究了熒光探針經(jīng)內耳給藥后的轉運通路，在熒光成像系統下追蹤了整個(gè)運輸過(guò)程。鐘華等構建了一種裝載抗癌藥物阿霉素的新型納米膠囊，采用激光共聚焦顯微鏡實(shí)時(shí)跟蹤觀(guān)察藥物投遞釋放過(guò)程，為新劑型的研究提供了理論平臺。目前，類(lèi)似的研究雖然較多，但仍處于理論研究階段，諸如熒光探針毒性、生物體內相容性等問(wèn)題還沒(méi)有解決，沒(méi)有合理的規范，難以規�；a(chǎn)。
4結論與展望
熒光成像技術(shù)的迅速發(fā)展加深了人們在分子水平對生命科學(xué)的了解，生命科學(xué)的研究也進(jìn)一步推進(jìn)了熒光成像技術(shù)的發(fā)展。激光共聚焦顯微鏡操作簡(jiǎn)單，應用廣泛，熒光探針易于制備，熒光信號強，熒光成像技術(shù)可用于蛋白質(zhì)、金屬離子的檢測，在腫瘤等疾病的檢測中也起著(zhù)重要作用，還可以實(shí)時(shí)跟蹤檢測給藥過(guò)程，為藥物新劑型的研究提供新的平臺。目前，熒光成像技術(shù)仍存在許多不足，主要為：細胞在可見(jiàn)光區有自發(fā)熒光，掩蓋了標記分子信號；難以實(shí)現對分子的長(cháng)期標記檢測。熒光成像技術(shù)是基礎研究和實(shí)際應用間的重要紐帶，三者將相互促進(jìn)，不斷進(jìn)步。
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