極低頻電磁場(chǎng)照射后細胞間的通訊
摘要：低頻脈沖電磁場(chǎng)能夠影響成骨細胞的增殖, 但其機理還有待研究。 使用15 Hz, 4 mT 矩形電磁場(chǎng)照射新生鼠顱骨細胞, MTT 方法測量細胞的增殖率, 通過(guò)電磁屏蔽與光隔離方法研究細胞間的通訊。 結果表明, 電磁場(chǎng)照射后的細胞能夠輻射一種光信號, 受電磁場(chǎng)照射的成骨細胞可以通過(guò)這種光輻射的通訊方式促進(jìn)未受電磁場(chǎng)照射的正常成骨細胞的增殖(P < 0。05)。
關(guān)鍵詞：電磁場(chǎng)、成骨細胞、增殖、通訊
低頻脈沖電磁場(chǎng)(PEMF)對骨不連病人的治療及骨愈合等疾病有顯著(zhù)的促進(jìn)作用[1,2], 特別是由于近年來(lái)環(huán)境中低頻電磁場(chǎng)污染的增加, 低頻電磁場(chǎng)生物效應已經(jīng)成為了社會(huì )廣泛關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題, 并引發(fā)了電磁場(chǎng)生物效應機理研究的熱潮[3~5]。 從電磁場(chǎng)作用后細胞的響應來(lái)看, 電磁場(chǎng)可以通過(guò)細胞外或細胞內鈣離子途徑直接影響成骨細胞的生長(cháng)與分化[6~8], 電磁場(chǎng)也可能通過(guò)對DNA的直接作用影響細胞的轉錄功能[9]。 從電磁場(chǎng)特征來(lái)看, 目前能夠肯定的是電磁場(chǎng)的生物效應存在強度與頻率窗口[10]。 電磁場(chǎng)生物效應機理的研究已經(jīng)有很多年的歷史, 但仍然沒(méi)有取得突破性的進(jìn)展, 還存在很多問(wèn)題, 表明電磁場(chǎng)生物效應的復雜性, 也提示我們應當更深入地研究其機理效應。 本文研究了電磁場(chǎng)刺激后細胞間的通訊問(wèn)題。
1 材料與方法
(ⅰ) 試劑。 本研究使用試劑包括DMEM 培養液(GIBCO 公司), 新生牛血清(杭州四季青生物制品公司), MTT(Sigma 公司)。
(ⅱ) 電磁場(chǎng)的產(chǎn)生。 電磁場(chǎng)發(fā)生儀自行研制,能夠在多層線(xiàn)圈繞制的螺線(xiàn)管內產(chǎn)生頻率、強度可調的矩形、正弦、三角等多種波形的低頻電磁波。 為了保證螺線(xiàn)管中電磁場(chǎng)比較均勻, 螺線(xiàn)管的直徑與長(cháng)度分別設計為5 和25 cm, 螺線(xiàn)管中磁感應強度按理論公式計算: B = μ0nI ( μ0 為真空磁導率, 其值為4π × 10−7H/m, n 為線(xiàn)圈單位長(cháng)度的匝數, I 為通過(guò)線(xiàn)圈的電流強度), 電流使用示波器及A622 探頭測量獲得(Tektronix,USA)。 本研究所用矩形波電磁場(chǎng)參數為: 頻率15 Hz,峰值強度4 mT, 占空比15%。
(ⅲ) 細胞培養。 無(wú)菌條件下, 取出生24 h 內的SD 大鼠顱蓋骨(購于第四軍醫大學(xué)實(shí)驗動(dòng)物中心),胰蛋白酶(1。25 g/L)消化20 min; 用10%血清的DMEM 培養基沖洗兩遍, 接種于培養瓶中, 待細胞長(cháng)滿(mǎn)培養瓶壁時(shí)傳代培養。 第3 代細胞用含10%血清的DMEM 培養基稀釋成5×104/mL 細胞的懸液, 以每孔200 μL 接種于由96 孔培養板加工而成的小孔中繼續培養24 h, 而后進(jìn)行分組實(shí)驗。 實(shí)驗分對照組與電磁照射組, 實(shí)驗時(shí)對照組與電磁照射組分別置于兩個(gè)完全一樣的螺線(xiàn)管中, 對照組不加電磁場(chǎng)放置30min, 電磁照射組加磁場(chǎng)照射30 min, 磁場(chǎng)方向與培養皿底部垂直, 而后繼續培養24 h, 照射兩次后用MTT 法檢測成骨細胞的增殖率。 為保證數據的準確性, 每個(gè)實(shí)驗至少重復2 次。
(ⅳ) 成骨細胞增殖檢測。 96 孔培養板的每孔內加入5 mg/mL 的MTT 溶液20 μL, 37℃孵育4 h, 吸盡培養基并于每孔加入二甲基亞砜150 μL, 振蕩10min, 用酶標儀(TECAN, 澳大利亞)測量570 nm 波長(cháng)時(shí)的光密度(A)值。
(ⅴ) 數據處理。 統計分析使用了Sigma Plot 軟件中的t 檢驗, 數據表示為X ± SD。
2 結果
電磁屏蔽實(shí)驗分為5 組。 其中有3 個(gè)對照組, 代分別稱(chēng)為對照組、電磁場(chǎng)屏蔽對照組(ESC)、無(wú)電磁場(chǎng)屏蔽對照組(ENSC)。 另2 個(gè)為電磁場(chǎng)照射組, 分別為電磁屏蔽的電磁場(chǎng)照射組(ESS)和無(wú)電磁屏蔽的電磁場(chǎng)照射組(ESNS)。 對照組與電磁照射組的實(shí)驗方法同上, 但電磁照射結束后, ESC 組與ESS 組分別用200 目銅網(wǎng)制成的長(cháng)方體箱包裹, 貼在一起共同放入培養箱培養, ESNS 組與ENSC 組直接貼在一起放入200 目銅網(wǎng)制作的長(cháng)方體箱中共同培養, 對照組置于銅網(wǎng)中單獨培養, 結果見(jiàn)圖1。 可以看出, 其他4 組與對照組差異顯著(zhù)(P < 0。05, n = 8), 但4 組之間無(wú)顯著(zhù)差異(P > 0。05, n = 8)。光隔離實(shí)驗也分為5 組。 其中3 個(gè)對照組分別為對照組、光未隔離對照組(LNIC)、光隔離對照組(LIC),2 個(gè)電磁照射組分別為光隔離的電磁場(chǎng)照射組(ELI)與光未隔離的電磁場(chǎng)照射組(ELNI)。 電磁照射的實(shí)驗方法同上, 但電磁照射結束后, LIC 與ELI 組用黑色玻璃片隔離后貼在一起共同放入培養箱培養,LNIC 組與ELNI 組用透明玻璃片隔離后貼在一起放入細胞培養箱培養, 對照組單獨培養, 結果見(jiàn)圖2。
可以看出, ELI, ELNI, LNIC 組與對照組差異顯著(zhù)(P <0。05, n = 8), LIC 組與對照組無(wú)顯著(zhù)差異(P > 0。05, n =8), 但與ELI 組顯著(zhù)差異(P < 0。05, n = 8)。
3 討論
電磁場(chǎng)生物效應是近年來(lái)的研究熱點(diǎn), 螺線(xiàn)管中交變磁場(chǎng)可以引起成骨細胞增殖[11], 4 mT, 15 Hz低頻矩形電磁場(chǎng)能夠使細胞增殖率顯著(zhù)增加[12], 本研究結果表明, 不但磁場(chǎng)照射后的成骨細胞增殖率可以顯著(zhù)增加, 而且與電磁場(chǎng)照射后的細胞相互接近共同培養的對照組細胞的增殖率也顯著(zhù)增高(圖1和2), 提示受磁場(chǎng)照射與未受磁場(chǎng)照射的細胞間存在影響細胞增殖的信號通訊。 細胞分裂過(guò)程中能夠產(chǎn)生一種特殊的物理信號, 通過(guò)這種物理信號能夠影響其他細胞的分裂[13]。 從物理學(xué)的角度分析, 細胞間的影響可能表現為電磁波通訊, 為此我們使用電磁屏蔽與光隔離的方法進(jìn)行了研究。 圖1 表明, 電磁屏蔽沒(méi)有影響細胞間的這種通訊, 因為無(wú)論是加了電磁屏蔽的細胞, 還是沒(méi)有被屏蔽的細胞, 只要將他們相互貼近一起培養, 電磁照射組與對照組細胞的增殖率就沒(méi)有差異, 但卻都顯著(zhù)高于對照組(P <0。05), 該結果提示, 細胞被磁照射后能夠產(chǎn)生使正常細胞增殖的信號, 而且這種信號不能被銅網(wǎng)產(chǎn)生的電磁屏蔽阻斷。 圖2 說(shuō)明, 這種影響細胞增殖的通訊信號可能是一種光信號, 因為正常細胞與受電磁刺激的細胞間的通訊作用可以被黑色玻璃片阻斷(P <0。05), 但不受透明玻璃片影響(P < 0。05)。 總之, 本研究結果表明, 成骨細胞被電磁照射后可能輻射一種光信號, 通過(guò)這種信號可以刺激其他未受電磁照射的細胞, 并使其增殖率增加。
成骨細胞的增殖與細胞因子及細胞內的鈣離子密切相關(guān)[3,14], 光輻射可以影響細胞內的鈣過(guò)程[15],這為本課題的后續深入研究提供了思路。
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