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血管性癡呆大鼠學(xué)習記憶障礙及發(fā)病機制
【摘要】 目的 研究血管性癡呆(VD)大鼠學(xué)習記憶障礙及發(fā)病機制。方法 4血管阻斷法制作模型，Morris水迷宮法檢測學(xué)習記憶能力，免疫組化法觀(guān)察Bcl?2和Bax表達，流式細胞術(shù)檢測海馬神經(jīng)細胞凋亡率，亞甲藍比色法檢測血清中H2S含量。結果 模型組大鼠學(xué)習記憶能力明顯減退。Bcl?2/Bax在缺血再灌注(I/R)開(kāi)始時(shí)升高，隨后開(kāi)始下降。模型組大鼠海馬神經(jīng)細胞凋亡率明顯增加。模型組大鼠血清中H2S含量明顯減少。血清H2S含量與海馬神經(jīng)細胞凋亡率間呈明顯負相關(guān)。 結論 VD可導致學(xué)習記憶障礙，海馬神經(jīng)細胞凋亡和血清中H2S含量減少;海馬神經(jīng)細胞凋亡程度可能與內源性H2S生成減少有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】 血管性癡呆;學(xué)習記憶;免疫組化;流式細胞術(shù);硫化氫
血管性癡呆(VD)是老年期癡呆的主要類(lèi)型之一，它是由一系列腦血管因素(缺血、出血、急慢性缺氧性腦血管病等)導致腦組織損害引起的以認知功能障礙為特征的癡呆綜合征〔1〕，不僅給病人帶來(lái)長(cháng)期痛苦，嚴重影響其生活質(zhì)量，而且給家庭、社會(huì )造成沉重負擔，因此研究VD的發(fā)病機制以指導其防治具有很高的社會(huì )價(jià)值和現實(shí)意義。H2S是第三類(lèi)氣體信號分子，廣泛參與機體的多種生理和病理過(guò)程，為進(jìn)一步了解其在VD發(fā)病中的作用，本研究觀(guān)察大腦缺血/再灌注(I/R)不同時(shí)間對大鼠學(xué)習記憶能力的影響、血清中H2S含量改變及海馬CA1區神經(jīng)細胞凋亡情況，從行為學(xué)、細胞凋亡及內源性H2S表達量及其相互關(guān)系等方面，探討VD的發(fā)病機制，為其防治提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 動(dòng)物與分組 健康Wistar雄性大鼠64只，體重300～350 g(由河北省實(shí)驗動(dòng)物中心提供)，隨機分為8組，正常組，假手術(shù)組和VD模型組，VD模型組又分為大腦I/R 2，8，24，72，168和720 h組，每組8只動(dòng)物。
1.2 動(dòng)物模型制備 4血管阻斷法(4?VO法)〔2〕建立VD大鼠模型。假手術(shù)組麻醉及手術(shù)過(guò)程與VD模型組相同，但不電凝雙側椎動(dòng)脈，不阻斷雙側頸總動(dòng)脈。術(shù)后按再灌注的不同時(shí)間分別將動(dòng)物處死,經(jīng)主動(dòng)脈依次灌注生理鹽水100 ml和4%多聚甲醛500 ml，取出腦組織，石蠟包埋切片，用于免疫組化顯示Bcl?2、Bax及蘇木素?伊紅(HE)染色。
1.3 學(xué)習記憶能力的測定 Morris水迷宮檢測〔3〕：實(shí)驗開(kāi)始于VD術(shù)后4 w，預先將迷宮任意分為4個(gè)象限。平臺放入上述4個(gè)象限中隨機選擇的1個(gè)象限中，在大鼠游泳池邊標記4點(diǎn)作為大鼠的入水點(diǎn)，記錄120 s內大鼠從入水到爬上平臺所需的時(shí)間，即逃避潛伏期。記錄各組大鼠的逃避潛伏期，作為學(xué)習記憶能力檢測指標。
1.4 取材 大鼠10%水合氯醛(3 ml/kg體重)腹腔注射麻醉后，快速開(kāi)胸暴露心臟，心尖取血4～5 ml，分離血清，用于血清H2S含量測定;然后斷頭處死，并立即在冰臺上開(kāi)顱，迅速分離大鼠海馬，用70%酒精固定，4℃冰箱保存過(guò)夜，用于流式細胞術(shù)檢測。
1.5 HE染色 切片常規脫蠟至水→1%鹽酸酒精分化→伊紅染色2 min→切片常規梯度酒精脫水→二甲苯Ⅰ→二甲苯Ⅱ→中性樹(shù)膠封固。
1.6 免疫組化染色(SP法) Bax兔抗鼠多克隆抗體，Bcl?2兔抗鼠多克隆抗體(Santa Cruz公司生產(chǎn))。
1.7 流式細胞術(shù)檢測 采用美國B(niǎo)eckman Coulter公司生產(chǎn)的Epics?XL Ⅱ型流式細胞儀。
1.8 血清中H2S含量的檢測 亞甲藍分光光度法。
1.9 統計學(xué)處理 用SPSS13.0統計軟件，采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK法。
2 結 果
2.1 學(xué)習記憶能力檢測結果 各組大鼠在迷宮各入水點(diǎn)搜索平臺的結果見(jiàn)表1，隨著(zhù)訓練天數的增加，各組大鼠的逃避潛伏期均縮短，第2天I/R 720 h組與正常組和假手術(shù)組比較逃避潛伏期明顯延長(cháng)(P<0.01);正常組和假手術(shù)組逃避潛伏期差異不顯著(zhù)(P>0.05)。
2.2 VD大鼠病理形態(tài)學(xué)結果 HE染色后，神經(jīng)細胞胞漿呈淡紅色，核呈藍黑色。假手術(shù)組大鼠海馬CA1區神經(jīng)元排列整齊、密集，細胞完整，結構正常，胞漿豐富，膠質(zhì)細胞無(wú)增生;細胞核呈圓形、橢圓形，無(wú)變性，無(wú)固縮或溶解現象。VD模型組海馬CA1區神經(jīng)元排列紊亂，神經(jīng)元變性，體積變小，胞核與胞漿界限不清，核固縮成三角形或不規則形，而且隨I/R時(shí)間的延長(cháng)，變性神經(jīng)元數目越多，見(jiàn)圖1�！”�1 各組逃避潛伏期比較
2.3 凋亡蛋白表達結果
2.3.1 VD大鼠模型海馬CA1區Bcl?2表達 VD模型組I/R 2 h Bcl?2蛋白平均OD值開(kāi)始明顯上調，I/R 8 h達到高峰，之后隨I/R時(shí)間的延長(cháng)開(kāi)始下降，但I/R 24 h組仍高于假手術(shù)組。假手術(shù)組與I/R不同時(shí)間點(diǎn)組間，Bcl?2的表達情況均有顯著(zhù)差異(P<0.01)(表2)。
2.3.2 VD大鼠模型海馬CA1區Bax的表達 I/R早期Bax在海馬CA1區的表達明顯增強，隨著(zhù)再灌注時(shí)間的延長(cháng)，其表達量不斷增加，I/R 72～168 h達高峰。假手術(shù)組與I/R不同時(shí)間點(diǎn)組之間，Bax的表達均有顯著(zhù)差異(P<0.01)(表2)。
2.3.3 Bcl?2/Bax比率變化 隨I/R時(shí)間的延長(cháng)，Bcl?2/Bax的比率逐漸降低(表2)。表2 VD大鼠Bcl?2、Bax的表達水平與假手術(shù)組比較：1)P<0.05，2)P<0.01
2.4 流式細胞術(shù)檢測海馬神經(jīng)細胞凋亡率結果 隨著(zhù)I/R時(shí)間的延長(cháng)，大鼠海馬神經(jīng)細胞凋亡率逐漸增高，其中I/R 2 h組凋亡率最低，I/R 168 h組凋亡率最高。VD模型各時(shí)間組與假手術(shù)組比較，海馬神經(jīng)細胞凋亡率明顯增加(P<0.01);I/R不同時(shí)間組間兩兩比較，各組間海馬神經(jīng)細胞凋亡率均差異顯著(zhù)(P<0.01)，見(jiàn)表3。
2.5 血清H2S含量檢測結果 隨著(zhù)I/R時(shí)間的延長(cháng)，大鼠血清H2S含量呈現直線(xiàn)降低趨勢，其中IR 2 h組血清H2S含量最高，I/R 168 h組血清H2S含量最低。VD模型各時(shí)間組與正常組和假手術(shù)組比較，血清H2S含量明顯減少(P<0.01);I/R不同時(shí)間組間兩兩比較，血清H2S含量均差異顯著(zhù)(P<0.01);正常組和假手術(shù)組血清H2S含量無(wú)顯著(zhù)差異(P>0.05)，見(jiàn)表3。
2.6 血清H2S含量與海馬神經(jīng)細胞凋亡率相關(guān)分析 隨著(zhù)血清H2S含量的降低，海馬神經(jīng)細胞凋亡率逐漸升高，兩者呈現明顯的負相關(guān)，回歸方程為：y=-0.135x+12.068，相關(guān)系數r=-0.861(P<0.01)，提示內源性H2S可能具有保護神經(jīng)細胞的功能。表3 各組海馬神經(jīng)細胞凋亡率及血清H2S含量(各組間兩兩比較：1)P<0.01
3 討 論
目前認為，I/R后神經(jīng)元死亡的機制是損傷級聯(lián)反應，腦缺血性損傷級聯(lián)反應大多以能量衰竭和興奮性氨基酸毒性開(kāi)始，以細胞凋亡結束。本實(shí)驗中用HE染色觀(guān)察到海馬CA1區大量細胞呈現明顯的凋亡特征，VD模型組大鼠海馬CA1區可見(jiàn)神經(jīng)元排列紊亂，神經(jīng)元變性，體積變小，核固縮成三角形或不規則形，胞核與胞漿界限不清。流式細胞術(shù)檢測海馬神經(jīng)細胞的凋亡率發(fā)現VD模型各組與假手術(shù)組相比海馬神經(jīng)細胞凋亡率明顯增加，而且隨著(zhù)I/R時(shí)間的延長(cháng)，大鼠海馬神經(jīng)細胞的凋亡率逐漸增加。
在參與調控神經(jīng)元凋亡的基因和蛋白質(zhì)產(chǎn)物中，一類(lèi)是抗凋亡蛋白，包括Bcl?2，Bcl?xL，Bcl?ω，Al等;另一類(lèi)是促凋亡蛋白，包括Bax、Bak、Bad等〔4〕。體外研究顯示〔5〕：Bcl?2保護細胞免于各種損傷。本實(shí)驗結果顯示VD模型組I/R 2 h后Bcl?2蛋白平均光密度值開(kāi)始明顯上調，IR 8 h達到高峰，之后開(kāi)始下降，但IR 72 h仍高于假手術(shù)組;而B(niǎo)ax蛋白在I/R早期在海馬CA1區的表達明顯增強，且隨著(zhù)再灌注時(shí)間的延長(cháng)，其表達不斷增加。Bcl?2蛋白家族中促凋亡和抑凋亡兩類(lèi)蛋白的比例即Bcl?2/Bax的比率決定細胞在受到凋亡信號刺激后是否發(fā)生凋亡〔6〕，本次研究顯示Bcl?2/Bax的比率隨I/R時(shí)間的延長(cháng)逐漸降低，而大鼠海馬神經(jīng)細胞的凋亡率則逐漸增加，這也從另一方面證實(shí)了Bcl?2蛋白的抗凋亡作用。
VD主要表現為學(xué)習記憶能力的降低，而海馬是學(xué)習記憶的重要結構，I/R損傷后海馬區的神經(jīng)細胞凋亡勢必對學(xué)習記憶功能產(chǎn)生重要的影響。本研究利用Morris水迷宮技術(shù)對VD模型大鼠的空間學(xué)習記憶能力進(jìn)行測試，發(fā)現I/R 720 h組較正常組和假手術(shù)組的逃避潛伏期明顯延長(cháng)，表明VD可造成大鼠學(xué)習記憶功能障礙，其機制可能是I/R損傷引起海馬神經(jīng)細胞凋亡，從而導致海馬學(xué)習記憶功能障礙。
H2S是繼一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)之后被發(fā)現的另一種具有神經(jīng)調節作用的新型氣體信號分子〔7〕，H2S不僅在神經(jīng)系統發(fā)揮重要的生理作用，而且還可作為一種內源性的抗氧化劑，在氧化應激時(shí)能夠清除羥自由基等活性氧簇〔8，9〕，具有抗氧化、恢復認知功能、調節腦血流量等作用，也提示H2S可能也參與老年癡呆動(dòng)物或病人神經(jīng)元的保護〔10〕。本研究結果顯示隨著(zhù)大腦I/R時(shí)間的延長(cháng)，各組大鼠血清H2S含量均減少，而海馬CA1區凋亡神經(jīng)細胞數逐漸增加;隨著(zhù)血清H2S含量的降低，海馬神經(jīng)細胞凋亡率逐漸升高，兩者間呈現明顯的負相關(guān)關(guān)系，提示內源性H2S對腦I/R損傷中的神經(jīng)細胞具有保護作用，可以減少細胞凋亡的發(fā)生。關(guān)于H2S發(fā)揮保護作用的機制尚不十分清楚，有研究表明，對于體外培養的心肌細胞，H2S可通過(guò)直接清除H2O2和O?2而減少脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA的生成〔11〕;對于神經(jīng)細胞，H2S可抑制過(guò)氧亞硝酸鹽介導的細胞毒性作用，抑制細胞內蛋白質(zhì)分子的氧化和硝基化〔8〕，或者通過(guò)促進(jìn)還原型谷胱甘肽的產(chǎn)生而對抗氧化應激損傷〔9〕，H2S被證實(shí)可激活ATP敏感的K通道(KATP)〔12〕，從而起到細胞保護作用。綜上所述，I/R損傷可引起內源性H2S含量降低，從而導致海馬神經(jīng)細胞凋亡率升高;I/R損傷后大鼠學(xué)習記憶功能障礙是海馬神經(jīng)細胞凋亡的必然結果。因此，提供外源性H2S或H2S供體以降低海馬神經(jīng)細胞凋亡率可能是治療VD的新方法。
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