瘧原蟲(chóng)抗藥性的遺傳學(xué)研究進(jìn)展

瘧原蟲(chóng)抗藥性的遺傳學(xué)研究進(jìn)展 關(guān)鍵詞：瘧原蟲(chóng)屬；抗瘧藥；抗藥性；基因

　　摘　要　瘧原蟲(chóng)產(chǎn)生抗藥性是瘧疾防治中遇到的主要難題之一�？谷~酸類(lèi)抗瘧藥的抗藥性機制已基本搞清，與其作用靶酶二氫葉酸還原酶或二氫蝶酸合成酶基因點(diǎn)突變相關(guān)。喹啉類(lèi)藥物抗性影響因子尚不完全清楚。惡性瘧原蟲(chóng)5號染色體上的多藥耐藥基因1及7號染色體上的cg2基因可能是抗性相關(guān)基因，但二者都不能完全解釋抗性，尚待深入研究。
　　瘧疾的流行至今仍然十分廣泛，遍及全球90多個(gè)國家和地區，20億人面臨感染瘧疾的危險。據統計，全球每年有3億～5億瘧疾病例，導致150萬(wàn)～270萬(wàn)人死亡，其中100萬(wàn)是居住在非洲的5歲以下兒童［1］。人類(lèi)在長(cháng)期實(shí)踐過(guò)程中篩選了大量防治瘧疾的藥物，但是，自從50年代末在東南亞和南美洲分別發(fā)現惡性瘧原蟲(chóng)對氯喹產(chǎn)生抗藥性以后，抗氯喹惡性瘧迅速擴散蔓延，抗藥性程度不斷增加，并且從單藥抗藥性向多藥抗藥性發(fā)展。我國的海南、云南和廣西等省、自治區也有抗藥性瘧疾的流行。目前，瘧原蟲(chóng)對幾乎每一種抗瘧藥都產(chǎn)生了抗性，瘧疾防治形勢非常嚴峻，迫切要求我們盡快搞清抗藥性產(chǎn)生的機制，以便采取措施防止或逆轉抗藥性的發(fā)生并指導新藥研究。近年來(lái)，分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展及學(xué)科滲透大大推動(dòng)了瘧原蟲(chóng)抗藥性機制的遺傳學(xué)研究，本文就抗葉酸制劑及喹啉類(lèi)藥物抗性的分子機制作一綜述。
　　1　抗葉酸制劑抗性的分子機制
　　1.1　二氫葉酸還原酶（DHFR）基因
　　乙胺嘧啶和環(huán)氯胍都是二氫葉酸還原酶抑制劑。研究表明，惡性瘧原蟲(chóng)對兩藥產(chǎn)生抗藥性都與DHFR基因點(diǎn)突變相關(guān)，但二者存在差異［2,3］。迄今為止，共報道了6個(gè)DHFR基因編碼區變異：108位Ser→Asn或Thr,51位Asn→Ile,59位Cys→Arg,16位Ala→Val,164位Ile→Leu。單一點(diǎn)突變所致DHFR108位Ser變異成Asn即可產(chǎn)生乙胺嘧啶抗性，但對環(huán)氯胍的反應性?xún)H稍有降低。對乙胺嘧啶產(chǎn)生高度抗性則需其他位點(diǎn)突變共存，包括51位Asn→Ile和（或）59位Cys→Arg。而與環(huán)氯胍抗性相關(guān)的變異是DHFR108位Ser→Thr伴隨16位Ala→Val，同樣，該抗性株對乙胺嘧啶的敏感性變化不大。
　　另外，在對乙胺嘧啶和環(huán)氯胍交叉耐藥的惡性瘧原蟲(chóng)中發(fā)現存在多個(gè)位點(diǎn)變異：DHFR164位Ile→Leu,108位Ser→Asn,59位Cys→Arg和（或）51位Asn→Ile。由于僅包含Asn-108和Arg-59變異的原蟲(chóng)分離物不具有環(huán)氯胍抗性，因此，認為L(cháng)eu-164變異在瘧原蟲(chóng)對兩藥產(chǎn)生交叉抗性的機制中起重要作用［3］。
　　1.2　二氫蝶酸合成酶（DHPS）基因
　　磺胺類(lèi)藥是二氫蝶酸合成酶抑制劑。研究發(fā)現，正是由于磺胺類(lèi)藥作用的靶酶DHPS基因點(diǎn)突變，使得酶活性中心結構域形狀改變，因而降低了對藥物的敏感性。體外低葉酸條件下實(shí)驗表明［4］，與磺胺多辛易感性降低相關(guān)的DHPS氨基酸變異主要包括581位Ala→Gly,436位Ser→Phe伴隨613位Ala→Thr/Ser,以及436位Ser→Ala,437位Ala→Gly。
　　磺胺多辛通常與乙胺嘧啶合用于治療惡性瘧疾。對兩藥聯(lián)用的體外研究揭示，瘧原蟲(chóng)對乙胺嘧啶的易感性決定著(zhù)兩藥協(xié)同作用的效果［5］。體內研究也發(fā)現［6］，前面所述的DHFR變異類(lèi)型均存在并與抗性程度相關(guān)，而DHPS基因突變與抗性的發(fā)生沒(méi)有明顯相關(guān)性，僅在抗性程度較高的玻利維亞地區可見(jiàn)Gly-581高度流行,Gly-437和Glu-540的發(fā)生與用乙胺嘧啶-磺胺多辛治療失敗率相當，這可能由于體外研究中葉酸和PABA水平不同于體內。另一種解釋是Ala-436的變異可能僅在低度抗性時(shí)出現，且不與高度抗性時(shí)的變異Gly-437,Glu-540和Gly-581共存。因此推測，DHPS變異在臨床乙胺嘧啶-磺胺多辛抗性的產(chǎn)生中不起主導作用。
　　我們能夠肯定，體內乙胺嘧啶-磺胺多辛抗性與DHFR基因突變相關(guān)，然而在抗性瘧流行區治療失敗率并不像突變發(fā)生率那樣高，提示體外研究發(fā)現的三種變異Asn-108，Ile-51和Arg-59不能完全解釋體內高度抗性。在玻利維亞的高度抗性病例中曾發(fā)現Leu-164及另外兩個(gè)新的變異Arg-50和插入30-31位間的玻利維亞重復區高度流行，提示這些變異可能是在抗性發(fā)展的較高時(shí)期產(chǎn)生的，關(guān)系到治療的成敗。據此Plowe等［6］提出假設，體內乙胺嘧啶-磺胺多辛抗性程度分級RⅠ,RⅡ,RⅢ正是基于DHFR和DHPS基因突變的不斷積累。由于現實(shí)中惡性瘧原蟲(chóng)感染的復雜性及宿主免疫與葉酸水平的影響，事實(shí)上所檢測到的抗性突變往往是交叉重疊的。
　　總之，關(guān)于抗葉酸制劑的抗藥性分子機制已基本搞清。因此，我們可以根據特有的突變類(lèi)型，運用分子生物學(xué)的方法，進(jìn)行大規模的流行病學(xué)研究，這對于鑒定某一瘧疾流行區的藥物敏感性，從而指導臨床用藥具有重要意義；同時(shí)也可指導新藥設計及臨床藥物聯(lián)用，以最大限度地減少藥物抗性的發(fā)生。
　　2　喹啉類(lèi)藥物抗性的分子機制
　　氯喹曾經(jīng)是使用最廣泛的抗瘧藥，由于抗性的發(fā)展及傳播，在大部分地區已不再具有以往的效力。影響抗性機理最終闡明的重要因素是喹啉類(lèi)藥物作用機制還不十分清楚。不同地區的研究者報道關(guān)于氯喹抗性的一個(gè)共同特征是：抗氯喹蟲(chóng)株較敏感性蟲(chóng)株藥物聚集水平降低了。因此，氯喹的轉運和聚集不僅對其發(fā)揮抗瘧活性是必需的，而且與抗性表型密切相關(guān)，提示喹啉類(lèi)藥物抗性產(chǎn)生可能與其作用方式?jīng)]有直接關(guān)系，這與抗葉酸制劑不同。
　　2.1　惡性瘧原蟲(chóng)多藥耐藥基因（pfmdr1和pfmdr2）
　　研究發(fā)現，維拉帕米（一種鈣通道阻滯劑）可逆轉氯喹抗藥性，促使人們考慮氯喹抗性可能與哺乳動(dòng)物腫瘤細胞多藥抗藥性（MDR）表型相似［7］。研究表明，腫瘤細胞產(chǎn)生MDR是由于一種ATP依賴(lài)性的、與藥物外排相關(guān)的蛋白過(guò)量表達所致，稱(chēng)為P-糖蛋白，它定位于細胞表面，與許多不同類(lèi)型的化合物有親合力［8］。在此基礎上，Krogstad等［9］發(fā)現抗氯喹株原蟲(chóng)較敏感株排出氯喹的速率快40～50倍，且這種排出是能量依賴(lài)性的，并可被能量缺乏及ATP阻斷劑抑制。但是也有研究顯示,抗氯喹株與敏感株藥物外排率相等［10］；二者藥物聚集量的差別是由于最初的藥物攝入速率不同所致［11］。
　　哺乳動(dòng)物MDR表型通常伴有mdr基因的擴增，導致其產(chǎn)物P-糖蛋白表達增加［8］。對惡性瘧原蟲(chóng)基因的研究表明也存在mdr基因同系物，以pfmdr1和pfmdr2為主［12，13］。目前尚無(wú)證據表明pfmdr2及其表達產(chǎn)物與氯喹抗性有關(guān)，而有相當多的研究認為pfmdr1與抗藥性機制相關(guān)。
　　Pfmdr1編碼一個(gè)相對分子質(zhì)量約162的蛋白，稱(chēng)為P-糖蛋白同系物1（Pgh1）。早期研究表明，在一些抗氯喹株中存在pfmdr1擴增［12，13］。免疫熒光及免疫電鏡技術(shù)觀(guān)察pfmdr1蛋白產(chǎn)物，發(fā)現Pgh1在紅內期表達，主要定位于食物泡膜上，這與它可能充當氯喹轉運蛋白的角色一致，但是定量分析不能確認Pgh1過(guò)表達與抗藥性相關(guān)［14］。
　　Foote等［15］對pfmdr1基因3′多態(tài)性及等位基因變異分析表明，pfmdr1突變與氯喹抗性表型相關(guān)，并提出存在兩種類(lèi)型抗性相關(guān)等位基因，一種可致單一氨基酸變異86位Asn→Tyr，為K1型；另一種則導致三種氨基酸變異，1034位Ser→Cys、1042位Asn→Asp和1246位Asp→Try,為7G8型。這可能分別代表著(zhù)最早在東南亞和南美洲出現的氯喹抗性類(lèi)型。以此為基礎，運用單盲法研究，曾正確地預測了36份樣品中的34份的藥物易感性。Adagu等［16］的研究也表明86位Tyr突變與氯喹抗性相關(guān)。但是，同時(shí)有些研究不能得到相同的結果。這提示可能pfmdr1不是唯一的控制抗性的基因。
　　氯喹抗性與pfmdr1的關(guān)系尚不明確，從選自氯喹抗性親代的甲氟喹抗性株中卻發(fā)現有pfmdr1的擴增，并且蟲(chóng)株對甲氟喹抗性增加的同時(shí)對氯喹的易感性增加了［12］。Barnes等［17］的研究表明，隨著(zhù)原蟲(chóng)對氯喹抗性的增加，pfmdr1基因拷貝數減少，甲氟喹易感性增加，這無(wú)疑加強了pfmdr1擴增與甲氟喹抗性的關(guān)聯(lián)。因此推測pfmdr1擴增可能與氯喹高度抗性是不相容的，Pgh1的功能可能是促進(jìn)對氯喹的易感性。
　　將pfmdr1基因轉染于異源表達系統中國倉鼠卵巢細胞（CHO），使其表達惡性瘧原蟲(chóng)Pgh1，發(fā)現Pgh1表達伴隨有能量依賴(lài)性的藥物攝入增加［18］，而且Pgh1就定位于轉染的CHO細胞溶酶體上，經(jīng)測定，發(fā)現轉染細胞溶酶體內pH值有所下降，認為氯喹聚集增加可能是溶酶體酸化的結果，推測pfmdr1可能編碼一種液泡氯化物通道。當CHO細胞被攜帶有7G8型1034和1042位突變的pfmdr1基因轉染時(shí)，則發(fā)現氯喹易感性喪失，細胞聚集藥物及酸化溶酶體的能力減弱，這就從某種意義上證實(shí)了關(guān)于Pgh1促進(jìn)氯喹易感性的推測。但這仍不足以解釋抗性。Ritchie等［19］發(fā)現源自氯喹抗性親代的鹵泛曲林抗株表現對鹵泛曲林、甲氟喹和奎寧敏感性降低而對氯喹敏感性增強，卻未檢測到任何pfmdr1基因序列或拷貝數及Pgh1表達的變化。
　　很明顯，關(guān)于pfmdr1與喹啉類(lèi)藥物抗性的關(guān)系仍有很大疑問(wèn)，可能抗性的發(fā)生有一定的地理學(xué)基礎，而尋找某個(gè)單一的基因來(lái)解釋抗性本身過(guò)于簡(jiǎn)單化，氯喹抗性發(fā)生的緩慢及復雜性也不支持單基因決定抗性的假設。

下一頁(yè)

【瘧原蟲(chóng)抗藥性的遺傳學(xué)研究進(jìn)展】相關(guān)文章：

腦血管疾病和卒中的遺傳學(xué)進(jìn)展03-08

紅花的現代研究進(jìn)展03-18

降脂中藥研究進(jìn)展03-19

干細胞的研究進(jìn)展03-18

醫學(xué)遺傳學(xué)設計性實(shí)驗課教學(xué)改革探討11-26

青霉素結合蛋白與細菌對-內酰胺抗生素的抗藥性機理12-20

梯度功能材料的研究進(jìn)展03-28

親和超濾技術(shù)的研究進(jìn)展03-03

支原體感染研究進(jìn)展03-08