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生物質(zhì)炭鈍化修復Cd污染土壤的微生物機制論文
我國農田土壤重金屬鎘污染形勢嚴峻。研究報道，目前我國已有超過(guò)13萬(wàn)km2的耕地被Cd污染，包含11個(gè)省市，25個(gè)地區[1],污染范圍廣、規模大，對生態(tài)系統安全構成巨大的威脅。據近期調查顯示，土壤Cd污染物含量呈現從西北到東南，從東北到西南逐漸升高的地理分布態(tài)勢，且西南地區重金屬超標范圍較廣[2].顯然，重金屬Cd污染使南方紅壤生態(tài)系統已具風(fēng)險性，治理Cd污染紅壤迫在眉睫。生物、物理及化學(xué)多種常規方法被應用到污染土壤修復中。國外研究報道生物質(zhì)炭施用到Cd污染土壤，Cd的生物有效性大幅降低，Cd濃度下降到原來(lái)的10%[3].本課題組前期研究也顯示生物質(zhì)炭輸入到土壤后，Cd有效態(tài)下降，殘渣態(tài)上升，水稻生物有效性降低[4].說(shuō)明，生物質(zhì)炭是一種具有潛在應用價(jià)值的化學(xué)鈍化修復劑，但修復機制尚未有統一明確的說(shuō)法。已有研究顯示，生物質(zhì)炭緩解重金屬的負面環(huán)境效應受自身孔隙度、比表面積、含氧官能團等特性的影響，還和生物質(zhì)炭改善土壤p H值、有機質(zhì)含量等因素有關(guān)，此外也受制于生物質(zhì)炭類(lèi)型、添加量等因子[5-6].
微生物是土壤生命力不可或缺的部分，是土壤肥力、質(zhì)量、健康的敏感性衡量指標之一它對重金屬污染反應靈敏，當重金量超過(guò)臨界值時(shí)微生物量、活性[7]、種群結構及多樣性[8]受到脅迫降低。然而，某些種群微生物在重金屬污染土壤中依然能長(cháng)期生存，可見(jiàn)微生物憑借吸收、富集、溶解和沉淀手段反作用于重金屬。檸檬酸細菌就能固定土壤中的Cd2+[9].生物質(zhì)炭可提高土壤微生物的豐度、活性、改變群落結構和組分。已有研究證實(shí)了2種生物質(zhì)炭添加到土壤后均可以增加各類(lèi)菌群的含量，改變土壤的微生物群落結構[10].也有研究表明，生物質(zhì)炭添加前后，土壤中固氮菌的群落結構差異顯著(zhù)[11].團聚體是土壤基本結構單元和組成部分。重金屬Cd、微生物2者在不同粒級的土壤團聚體中表現出不同的空間行為。很早便有研究表明，大團聚體中細菌生物量明顯比真菌低，并且大團聚體數量束縛著(zhù)真菌生物量，與小團聚體相比，大團聚體的微生物量多[12].生物質(zhì)炭-土壤-微生物3者之間交互影響關(guān)系錯綜復雜，目前關(guān)于生物質(zhì)炭鈍化重金屬Cd的機理仍停滯在生物質(zhì)炭本身和土壤理化性質(zhì)2個(gè)方向，微生物這一因素卻鮮有研究�；谝陨媳尘�，本文選取外加Cd處理過(guò)的紅壤進(jìn)行室內實(shí)驗，對生物質(zhì)炭輸入后土壤團聚體中微生物種群在碳源代謝功能多樣性方面上的響應機制進(jìn)行研究，試圖從團聚體角度揭示生物質(zhì)炭鈍化修復Cd污染土壤的微生物機制，以期為南方紅壤土重金屬污染防治及紅壤生態(tài)系統安全保障提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 實(shí)驗材料
1.1.1 供試土壤本實(shí)驗的供試土壤為云南農業(yè)大學(xué)后山的山原紅壤，為云南典型紅壤，是可種植水稻的非水稻土，因重金屬含量接近本底值，對其進(jìn)行模擬實(shí)驗易探究Cd這一因素對紅壤微生物區系的作用及生物質(zhì)炭的恢復機制。p H值為5.35,電導率為420?s/cm,含有機質(zhì)44.26g/kg,有效磷64.55mg/kg,堿解氮99.05mg/kg.
1.1.2 生物質(zhì)炭本研究選取是河南三利公司生產(chǎn)的小麥商品秸稈生物質(zhì)炭。 p H值為9.03,有機碳543.7g/kg,全氮1.98g/kg,全磷3.2g/kg,全鉀28.65g/kg,比表面積23.26m2/g,陽(yáng)離子交換量185.56mol/kg.
1.2 實(shí)驗設計
實(shí)驗為盆栽模擬實(shí)驗，選用普通塑料桶，每桶裝8kg土。配制Cd Cl2母液，與土壤反復混合均勻。秸稈生物質(zhì)炭按照0%、2.5%、10%的質(zhì)量比添加到上述混勻土壤中（因在前期項目實(shí)驗中5%生物質(zhì)炭添加量下Cd形態(tài)、土壤酶活性沒(méi)有明顯變化，所以本實(shí)驗沒(méi)按照梯度設置生物質(zhì)炭添加量，選取了變化顯著(zhù)的2.5%、10%生物質(zhì)炭添加量）并設置無(wú)任何添加的空白對照組，既得到4種不同的處理：Cd添加量為0mg/kg,生物質(zhì)炭添加量為0%（簡(jiǎn)稱(chēng)為CK）；Cd添加量為2.5mg/kg,生物質(zhì)炭添加量為0%（簡(jiǎn)稱(chēng)為B0）；Cd添加量為2.5mg/kg,生 物 質(zhì) 炭 添 加 量 為2.5%（簡(jiǎn) 稱(chēng) 為B2.5）；Cd添加量為2.5mg/kg,生物質(zhì)炭添加量為10%（簡(jiǎn)稱(chēng)為B10）。每種處理設置3個(gè)平行對照組，置于溫室大棚中并種植水稻，調節并保持土壤濕度至田間持水量的70%,待水稻成長(cháng)到分蘗期時(shí)采集（5點(diǎn)法）各處理土壤進(jìn)行下一步實(shí)驗。
1.3 土壤團聚體的分離方法
采用Elliott[13]的濕篩法分離不同粒徑的團聚體。把清除石子和水稻根系的土壤放入孔徑為5、2、1、0.5、0.25mm的套篩中。套篩中倒入滅菌水，使水剛沒(méi)過(guò)最上層篩子，然后勻速上下移動(dòng)套篩15min,便得到>5mm、5~2mm、2~1mm、1~0.5mm、0.5~0.25mm、<0.25mm 6種不同粒徑團聚體。其中以0.25mm粒徑為界限分類(lèi)，大于它的為大團聚體，小于它的為微團聚體。
1.4 土壤微生物群落功能多樣性測定方法
本研究采用Biolog-ECO板分析土壤微生物群落的代謝功能特征。ECO板接種液的制備采用Classen等[14]的方法。稱(chēng)取相當于5g烘干質(zhì)量的新鮮土樣置于無(wú)菌三角瓶，加入45m L濃度為0.85%的無(wú)菌生理鹽水，200r/min振蕩30min后靜置15min,取5m L上清液至裝有45m L無(wú)菌生理鹽水的三角瓶中，重復稀釋3次，制得1:1000的接種液。將ECO板提前預熱到25℃，用八道移液搶取150?L接種液于每孔中。ECO板置于恒溫培養箱中，25℃左右避光培養7d,分別于4、24、48、96、120、144、168h用Biolog微生物自動(dòng)鑒定系統讀取590nm處吸光值，每板重復讀數3次。
1.5 數據處理
本文中土壤微生物整體活性用微平板每孔顏色平均變化率（AWCD）描述。土壤微生物群落功能多樣性用Shannon指數、Simpson指數與Mc Intosh指數表征。實(shí)驗數據的方差分析和主成分分析均用SPSS（19）軟件完成，Excel（2007）繪圖。具體數據處理公式詳見(jiàn)于表1.
2 結果與分析
2.1 不同處理下土壤團聚體微生物群落活性的變化
AWCD是溫育時(shí)間內Biolog每板的平均顏色變化率，能夠反映土壤微生物的活性、生理功能多樣性，它在時(shí)間維度上的變化可表征微生物的平均活性[15].如圖1所示，不同處理不同粒徑團聚體土壤微生物AWCD值均隨著(zhù)溫育時(shí)間延長(cháng)而增加，表明不同處理下各粒徑團聚體中土壤微生物碳源利用能力隨時(shí)間的延長(cháng)而增強。從時(shí)間維度上看，不同處理下各團聚體AWCD值4h之前接近0,碳源幾乎未被利用；4~24h之間增長(cháng)緩慢，碳源利用率低；24~120h時(shí)間段內快速增長(cháng)變化明顯，碳源被大幅度利用；120h增長(cháng)趨于平緩，碳源利用能力逐漸減弱。土壤微生物的整體代謝活性與AWCD值的增長(cháng)速率呈極顯著(zhù)的正比例關(guān)系，24~120h時(shí)間段內，碳源利用率強，微生物活性最強。各粒徑團聚體中4種處理的碳源利用率均呈B2.5>B10>CK>B0的規律，重金屬Cd污染致使土壤微生物碳源利用單一、利用能力弱，微生物代謝活性降低，施入生物質(zhì)炭的2個(gè)處理組碳源利用能力增強，微生物代謝活性得到提升并高于了CK空白對照組，尤其是B2.5處理組生物質(zhì)炭對土壤微生物活性影響顯著(zhù)。不同處理下6種大小不同粒徑的團聚體碳源利用能力從強到弱依次為：>5mm（10.55）團聚體、2~1mm（10.42）團聚體、<0.25mm（10.18）團聚體、5~2mm團聚體（8.50）、1~0.5mm（6.26）團聚體、0.5~0.25mm（5.00）。5~1mm大團聚體與<0.25mm的微團聚體中土壤微生物碳源代謝活性遠遠高于1~0.25mm團聚體，特別是在>5mm、2~1mm 2個(gè)粒徑團聚中碳源代謝活性達到峰值。<0.25mm的微團聚體中B0處理組AWCD值增長(cháng)最緩慢，與其余3個(gè)處理組相比微生物代謝活性差異明顯。
2.2 不同處理下土壤團聚體微生物多樣性指數的變化
Shannon多樣性指數是研究群落物種豐富度的綜合指標，Simpson指數較多反映了群落中最常見(jiàn)的物種優(yōu)勢度，Mc Intosh指數則是群落中物種均一性的度量[16]文中利用3種多樣性指數，在各土壤團聚體中培養時(shí)間段內AWCD值較穩定的120h的數據基礎上分析土壤微生物群落功能多樣性。由表2可知，首先，各粒徑團聚體中微生物的Shannon、Simpson、Mc Intosh 3種多樣性指數值4種處理均呈現B2.5>B10>CK>B0的規律。方差分析也顯示，添加生物質(zhì)炭的2個(gè)處理組與單加Cd對照處理組之間差異顯著(zhù)，表明重金屬Cd毒害作用迫使土壤微生物豐度降低，群落常見(jiàn)物種受到限制，物種均一性遭到破壞，而生物質(zhì)炭的施 入 對微生物 的 多樣性具 有 提升作用，B2.5處理組的作用效果尤為顯著(zhù)。其次，各處理下3種多樣性指數值均在5~1mm、<0.25mm粒>5mm、5~2mm、2~1mm、1~0.5mm、0.5~0.25mm、<0.25mm 6種不同粒徑團聚體中，添加生物質(zhì)炭的2個(gè)處理組與單加Cd的B0對照組相比，Shannon指 數 分 別 上 升 了24.62%, 34.30%,58.41%,52.88%,46.76%,131.25%;Simpson指數分別上升了24.44%,20.00%,36.11%,39.68%,44.07%,73.73%;Mc Intosh指 數 分 別 上 升 了32.68%,35.74%,86.36%,87.15%,84.73%,135.52%.由此可得出，生物質(zhì)炭對Cd污染土壤中微生物多樣性的提升作用隨著(zhù)團聚體的粒徑的減小呈波動(dòng)上升的趨勢，<0.25mm微團聚體中提升作用最為突出；從整體角度出發(fā)，它使Cd污染土壤中微生物群落物種的均一度發(fā)生了顯著(zhù)變化，群落物種的豐富度也得到一定的提升，但生物質(zhì)炭對群落中常見(jiàn)的微生物物種影響甚微。
2.3 不同處理下土壤團聚體微生物碳源利用特征變化
根據ECO板上31種碳源的結構與化學(xué)性質(zhì)，將其分為6大類(lèi)碳源化合物[17]:糖類(lèi)7種；羧酸類(lèi)9種；胺類(lèi)2種；氨基酸類(lèi)6種；聚合物類(lèi)4種；其他類(lèi)3種。對培養120h 6類(lèi)碳源化合物的AWCD值進(jìn)行分析。結果如圖2所示，首先，各粒徑土壤團聚體中微生物對6類(lèi)碳源化合物利用率4種處理也呈B2.5>B10>CK>B0的規律。顯而易見(jiàn)，重金屬Cd抑制土壤微生物對各類(lèi)碳源化合物的利用，生物質(zhì)炭對Cd污染土壤微生物碳源利用能力具有恢復效應，2.5%生物質(zhì)炭添加量的恢復效果最明顯，甚至還有一定的提升作用。這吻合于土壤微生物整體代謝活性，功能多樣性指數的分析結果。其次，各處理下土壤微生物6類(lèi)碳源利用強度的峰值現于5~1mm、<0.25mm粒徑團聚體中，谷值現于1~0.25mm粒徑團聚體中。
由圖3顯示，土壤團聚體中4個(gè)處理在PC軸上分異明顯且團聚體粒徑大小不同4個(gè)處理坐標位置也不同。5~0.25mm土壤團聚體B0和CK 2個(gè)處理組離散距離近，可得，單施Cd處理組與空白對照組的碳源利用能力相似，而<0.25mm土壤團聚中B0與其余3個(gè)處理組離散距離都遠，說(shuō)明B0與B2.5、B10、CK處理組之間碳源利用能力差異顯著(zhù)。各粒徑團聚體中，B0與B2.5、B10的距離都遠，表明，Cd脅迫下土壤微生物碳源利用能力減弱，生物質(zhì)炭的施入具有一定程度的提升作用。
縱觀(guān)土壤微生物6大類(lèi)碳源利用率從高到低依次為：聚合物類(lèi)（24.57%）、其他類(lèi)（20.82%）、糖 類(lèi)（19.42%）、 氨 基 酸 類(lèi)（17.54%）、 羧 酸 類(lèi)（10.02%）、胺類(lèi)（7.63%）。說(shuō)明，聚合物類(lèi)為多數團聚體中微生物代謝的優(yōu)勢碳源類(lèi)群，羧酸類(lèi)、胺類(lèi)為2類(lèi)劣勢代謝類(lèi)群。其中，與單加Cd的B0對照組相比，土壤團聚體中生物質(zhì)炭大幅提高了胺類(lèi)、羧酸類(lèi)、糖類(lèi)、聚合物類(lèi)、氨基酸類(lèi)碳源化合物的微生物利用能力，分別是B0組的4倍、3倍、3倍、3倍、2倍；而其他類(lèi)化合物僅是B0組的1倍�？梢�(jiàn)，除其他類(lèi)化合物外，生物質(zhì)炭顯著(zhù)提升其余5類(lèi)化合物利用能力，從相反視角來(lái)看，重金屬Cd刺激了土壤微生物利用其他類(lèi)化合物。土壤團聚體粒徑大小不同，生物質(zhì)炭輸入對Cd污染土壤中6大類(lèi)碳源化合物的微生物利用能力是具有選擇性的提升，<0.25mm團聚體生物質(zhì)炭添加后微生物對胺類(lèi)、糖類(lèi)、羧酸類(lèi)、聚合物類(lèi)、氨基酸類(lèi)、其他類(lèi)的利用能力分別是B0組的6倍、4倍、4倍、3倍、3倍、1倍，超出了6類(lèi)碳源化合物提升的平均水平，表明生物質(zhì)炭對<0.25mm粒徑團聚體中碳源化合物的利用率提升作用最顯著(zhù)。
2.4 不同處理下土壤團聚體微生物碳源利用特征主成分分析
為了進(jìn)一步了解不同處理下土壤微生物的碳源利用能力的差異，對不同土壤團聚體中各處理120h下31類(lèi)碳源進(jìn)行主成分分析（PCA）。經(jīng)分析，6個(gè)團聚體中31類(lèi)碳源中均提取了不少于7個(gè)的與土壤微生物碳源利用相關(guān)的主成分，累積方差貢獻率均大于90%.由于主成分1（PC1）、主成分2（PC2）的方差貢獻率較其余主成分大，各粒徑土壤團聚體中都選取這2個(gè)能聚集單一碳源的變量數據變異主成分作圖剖析。
表3可知，>5mm土壤團聚體中，對PC1貢獻大的（特征向量系數>0.5）有4種碳源化合物，分別是氨基酸類(lèi)（L-精氨酸、L-苯丙氨酸、L-絲氨酸）、羧酸類(lèi)（D-半乳糖醛酸、D-蘋(píng)果酸）、胺類(lèi)（腐胺）和聚合物類(lèi)（吐溫40）。對PC2貢獻大的碳源化合物有3種，糖類(lèi)（i-赤蘚糖醇、D-甘露醇、N-乙酰D-葡萄糖氨、D-纖維二糖、a-D-乳糖）、羧酸類(lèi)（D-半乳糖酸r內酯、D-半乳糖醛酸、a-丁酮酸）和胺類(lèi)（苯乙胺）。PC1和PC2共占微生物群落碳源利用率總變異的38.35%,是變異的主要來(lái)源。4種處理組土壤微生物在羧酸類(lèi)、糖類(lèi)和胺類(lèi)的利用上差異顯著(zhù)；5~2mm中對PC1貢獻大的有5種碳源化合物，糖類(lèi)（i-赤蘚糖醇、a-D-乳糖）、羧酸類(lèi)（衣康酸、a-丁酮酸）、胺類(lèi)（苯乙胺）、氨基酸類(lèi)（L-苯丙氨酸）和其他類(lèi)（1-磷酸葡萄糖）。對PC2貢獻大的碳源化合物有糖類(lèi)（D-木糖-戊醛糖）、羧酸類(lèi)（4-羥基苯甲酸）、胺類(lèi)（腐胺）和其他類(lèi)（D,L-a磷酸甘油）。2個(gè)主成分占總變異的35.87%,糖類(lèi)、羧酸類(lèi)、胺類(lèi)是促使4個(gè)處理產(chǎn)生差異的主要碳源化合物；2~1mm中糖類(lèi)（β-甲基-D-葡萄糖苷、D-甘露醇、N-乙酰-D葡萄糖氨、D-纖維二糖）、聚合物類(lèi)（吐溫40、吐溫80、a-環(huán)式糊精、肝糖）、羧酸類(lèi)（r-羥丁酸、D-蘋(píng)果酸）、氨基酸類(lèi)（L-精氨酸、甘氨酰-L-谷氨酸）、胺類(lèi)（腐胺）和其他類(lèi)（1-磷酸葡萄糖）對PC1貢獻大。糖類(lèi)（β-甲基-D-葡萄糖苷、a-D-乳糖）、聚合物類(lèi)（吐溫40、肝糖）、氨基酸類(lèi)（L-天門(mén)冬酰胺、L-蘇氨酸）和胺類(lèi)（苯乙胺）對PC2貢獻大。2個(gè)主成分占總變異的43.81%,糖類(lèi)、聚合物類(lèi)、氨基酸類(lèi)和胺類(lèi)碳源化合物導致4個(gè)處理碳源利用差異明顯，而聚合物類(lèi)4種全部碳源均對2個(gè)主成分貢獻突出，是差異產(chǎn)生的主控因子；1~0.5mm中4類(lèi)碳源化合物對PC1貢獻大，羧酸類(lèi)（D-半乳糖酸r內酯、2-羥基苯甲酸、4-羥基苯甲酸、r-羥丁酸）、糖類(lèi)（i-赤蘚糖醇、D-甘露醇、D-纖維二糖）、氨基酸類(lèi)（L-精氨酸、L-天門(mén)冬酰胺、L-蘇氨酸）和聚合物類(lèi)（肝糖）。對PC2貢獻大的有羧酸類(lèi)（D-半乳糖酸r內酯、D-半乳糖醛酸、衣康酸）、氨基酸類(lèi)（L-精氨酸、甘氨酰-L-谷氨酸）、胺類(lèi)（苯乙胺）。2個(gè)主成分占總變異的37.56%,4個(gè)處理碳源利用差異顯著(zhù)的關(guān)鍵因子是羧酸、氨基酸2類(lèi)碳源化合物；0.5~0.25mm土壤團聚中，PC1貢獻大的有4類(lèi)碳源化合物，羧酸類(lèi)（2-羥基苯甲酸、a-丁酮酸）、糖類(lèi)（D-木糖-戊醛糖、i-赤蘚糖醇）、胺類(lèi)（苯乙胺）和聚合物類(lèi)（吐溫80）。PC2貢獻大的有3類(lèi)碳源化合物，羧酸類(lèi)（D-半乳糖酸r內酯、D-半乳糖醛酸）、聚合物類(lèi)（吐溫40、吐溫80）、其他類(lèi)（1-磷酸葡萄糖、D,L-a磷酸甘油）。2個(gè)主成分占總變異的33.34%,羧酸類(lèi)、聚合物類(lèi)碳源化合物致使4個(gè)處理碳源利用差異顯著(zhù)；<0.25mm中糖類(lèi)（β-甲基-D-葡萄糖苷、D-甘露醇、D-纖維二糖、a-D-乳糖）、羧酸類(lèi)（D-半乳糖醛酸、4-羥基苯甲酸、D-蘋(píng)果酸）、氨基酸類(lèi)（L-精氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸）、聚合物類(lèi)（吐溫40）和其他類(lèi)（丙酮酸甲酯）對PC1貢獻大。糖類(lèi)（i-赤蘚糖醇、D-甘露醇、N-乙酰-D葡萄糖氨、D-纖維二糖、a-D-乳糖）、羧酸類(lèi)（D-半乳糖酸r內酯、a-丁酮酸）對PC2貢獻大。2個(gè)主成分占總變異的45.80%,4個(gè)處理在糖類(lèi)與羧酸類(lèi)碳源化合物的利用上差異明顯。綜上，羧酸類(lèi)、糖類(lèi)是4個(gè)處理之間碳源利用能力差異顯著(zhù)的主要影響因子。圖3坐標軸上，各粒徑土壤團聚體中B0與B2.5、B10 2個(gè)處理組之間分異最明顯，因而，生物質(zhì)炭處理組與單施Cd處理組碳源利用上起區分作用的是羧酸類(lèi)和糖類(lèi)碳源化合物。
3 討論
土壤環(huán)境質(zhì)量的評價(jià)指標包括土壤微生物種群特征、代謝活性和功能多樣性。本文研究顯示，各土壤團聚體中微生物的整體代謝活性、功能多樣性、碳源利用特征4個(gè)處理均呈現B2.5>B10>CK>B0的趨勢，表明重金屬Cd脅迫下土壤微生物的代謝功能多樣性明顯降低，生物質(zhì)炭轉變土壤微生物的代謝模式，緩解并提升功能多樣性，尤其2.5%低質(zhì)量分數的生物質(zhì)炭添加量提升效果最顯著(zhù)。重金屬Cd、Cu污染條件下木炭等改良劑修復可改善土壤微生物群落代謝功能多樣性[18]證實(shí)了本文研究結論。土壤微生物只能利用生物質(zhì)炭一小部分易分解的碳源[19],因而生物質(zhì)炭中C組分對Cd污染條件下土壤微生物的功能多樣性變化影響并不顯著(zhù)。一方面，生物質(zhì)炭物理結構空間大直接吸附土壤微生物于孔隙中，成為土壤微生物生活的載體，同時(shí)供給N、P、K、Ca等土壤微生物生長(cháng)代謝必不可少的營(yíng)養元素；另一方面，生物質(zhì)炭可通過(guò)吸附土壤中的重金屬Cd,降低其生物毒性，對土壤微生物產(chǎn)生保護作用。張陽(yáng)陽(yáng)等[20]的研究結果也為此做了輔證。但土壤微生物的豐度、Cd消減效果這2者與生物質(zhì)炭添加量并不一定成正比例關(guān)系。生物質(zhì)炭施用量高，土壤微生物生物量碳反而低[21],尤其易阻礙低養分土壤中固氮菌的生長(cháng)[22].重金屬Cd污染稻田經(jīng)生物質(zhì)炭修復后，1%低質(zhì)量分數生物質(zhì)炭用量下土壤中有效態(tài)Cd顯著(zhù)下降，稻粒中Cd含量也隨之降低[23].本文中生物質(zhì)炭添加量和生物質(zhì)炭對土壤微生物功能多樣性提升效果未呈直接線(xiàn)性關(guān)系，可能是實(shí)驗供試土壤為紅壤，養分含量低，2.5%低質(zhì)量分數生物質(zhì)炭用量下微生物豐度更高，且能更有效的降低Cd的微生物有效性。然而，生物質(zhì)炭添加量并不是Cd污染條件下土壤微生物功能多樣性提升的唯一制約因子，還可能與土壤養分變動(dòng)息息相關(guān)，它受土壤有機質(zhì)、N、P、K含量所制約[24].
土壤團聚體粒徑大小對微生物多樣性和群落結構比p H值等其它因素有更大影響[25],微生物代謝功能多樣性因土壤團聚體粒徑大小不同表現出差異。本研究表明各處理下土壤微生物的整體代謝活性、功能多樣性、碳源利用特征峰值均在5~1mm、<0.25mm粒徑團聚體中，谷值均在1~0.5mm粒徑團聚體中。土壤微生物代謝功能多樣性在不同團聚體中呈“v”型分布，分析其原因。首先，土壤大團聚體中生物質(zhì)炭通過(guò)改善土壤團聚體理化性質(zhì)，提高營(yíng)養物質(zhì)含量，直接影響微生物的代謝功能多樣性。土壤中有機質(zhì)的含量隨團聚體直徑的增大逐漸遞增[26],為大團聚體微生物提供充足的養分。土壤微生物功能多樣性與土壤總有機碳含量呈極顯著(zhù)的正相關(guān)關(guān)系[27].安艷等[28]研究表明，生物質(zhì)炭輸入后有機碳含量在5~1mm粒級團聚體中大幅增加。土壤團聚體含量增加可改善土壤結構和碳匯能力。有研究就顯示生物質(zhì)炭施用到紅壤后，>1mm粒級團聚體含量呈增加趨勢，土壤總有機碳在大團聚體中分配的比例也隨之增加[29].本文5~0.25mm大團聚體中土壤微生物代謝功能多樣性與團聚體粒徑大小呈負相關(guān)，這可能是因為有機質(zhì)、有機碳等微生物可利用底物含量，隨著(zhù)團聚體粒級的減小而逐漸減少。其次，土壤微團聚體中生物質(zhì)炭鈍化重金屬Cd,降低生物有效性間接影響微生物代謝功能多樣性。生物質(zhì)炭鈍化作用受不同粒級團聚體重金屬的富集特征束縛。微團聚體的外源Cd含量占全土中Cd含量的91.0%,微團聚體是Cd的主要富集場(chǎng)所[30].5~0.25mm大團聚體土壤微生物代謝功能多樣性呈下降趨勢，<0.25mm微團聚體中又大幅回升。這是Cd大量分布在微團聚體中，生物質(zhì)炭Cd鈍化效果比大團聚體更顯著(zhù)所致。最后，土壤微生物功能多樣性還受微生物本身情況約束。2~0.25mm團聚中細菌、放線(xiàn)菌和微生 物 總 量 隨 團 聚 體 粒 徑 增 大 逐 漸 增 加，而<0.25mm團聚體中隨粒徑的減小呈減少趨勢[31].5~1mm大團聚體中土壤微生物數量規模較大造成總體微生物碳源利用、代謝強度大，代謝功能多樣性高。<0.25mm微團聚體中土壤微生物數量規模小，但生物質(zhì)炭很大程度恢復Cd毒害的微生物代謝功能多樣性。文中<0.25mm的微團聚體中與其余3組處理相比，單施Cd的B0處理組微生物整體代謝活性明顯降低，生物質(zhì)炭對功能多樣性、6類(lèi)碳源化合物利用率的提升效果顯著(zhù)。B0與CK空白對照碳源利用能力大團聚體中相似，微團聚體中則大相徑庭。這些現象均與上述原因緊密相關(guān)，當然，不同種類(lèi)土壤微生物的團聚體空間分異特征及其對各類(lèi)碳源利用的選擇性也是其影響因子之一。
3種土壤功能多樣性指數解析闡明，Cd污染土壤中微生物群落物種的均一度對生物質(zhì)炭響應最靈敏，群落中常見(jiàn)的微生物物種卻沒(méi)有太大響應。張仕穎等[32]研究顯示，有機農藥輸入后土壤微生物的碳源利用能力集中，Simpson指數升高。研究中Simpson指數基本無(wú)變化，微生物對碳源利用能力均一，微生物分布均勻所以微生物均一度指數高。6類(lèi)碳源化合物分析可得，重金屬Cd脅迫下土壤微生物偏好于其他類(lèi)碳源化合物。低等程度有機污染刺激土壤中微生物利用胺/氨基化合物[33].重金屬復合污染程度與土壤微生物多樣性不完全呈負相關(guān)，中等污染程度多樣性指數高，微生物種群結構發(fā)生變化，某些抗重金屬菌群出現[34].本實(shí)驗外源Cd的用量為2.5mg/kg,模擬的是中低濃度Cd污染條件。耐Cd的抗性菌株在中低濃度污染的刺激下形成，且對其他類(lèi)碳源具有偏嗜性。主成分分析表示，生物質(zhì)炭處理組與單施Cd處理組碳源利用上起區分作用的是羧酸類(lèi)和糖類(lèi)碳源化合物。有實(shí)驗表明，重金屬污染條件下，糖類(lèi)、羧酸類(lèi)和氨基酸類(lèi)3類(lèi)化合物對土壤微生物的代謝模式起分異作用[35],這與本文結果較相似。本文利用Biolog微平板法探究外源Cd條件下生物質(zhì)炭輸入后不同粒級團聚體微生物在碳源代謝功能多樣性方面的響應機制。Biolog板中碳源底物種類(lèi)有限，而土壤微生物的數量龐大，種類(lèi)繁多，研究中所得代謝多樣性類(lèi)型不一定反映整個(gè)土壤微生物多樣性，只代表了可培養微生物。生物質(zhì)炭-重金屬Cd的耦合作用下，土壤微生物在微團聚體中的變化趨勢及規律同樣錯綜復雜，本研究對微團聚體中微生物多樣性探究尚未深入。因而有必要把研究視角切換到分子生物學(xué)上進(jìn)一步深入探究土壤微團聚體中微生物的種群結構及多樣性。
4 結論
4.1 重金屬Cd脅迫下土壤微生物偏好其他類(lèi)碳源化合物，代謝功能多樣性下降。生物質(zhì)炭施用起到一定的恢復效應并使微生物代謝模式發(fā)生轉變，2個(gè)生物質(zhì)炭處理組與單加Cd對照在羧酸類(lèi)、糖類(lèi)碳源化合物利用上差異明顯。但生物質(zhì)炭 這 種 恢 復 效 應 與 施 加 量 并 不 呈 線(xiàn) 性 關(guān)系，2.5mg/kg生物質(zhì)炭用量作用效果最顯著(zhù)。表明此生物質(zhì)炭量對土壤生態(tài)系統安全的微生態(tài)風(fēng)險有很強的規避性。
4.2 土壤微生物的代謝功能多樣性在不同粒級團聚中呈“V”型分布。5~0.25mm大團聚體Cd污染土壤微 生 物碳源利 用 能力與空 白 對照相似，<0.25mm微團聚體中差異顯著(zhù)，此團聚體中Cd土壤中微生物代謝功能多樣性脅迫效應最強，生物質(zhì)炭的保護效應也最明顯。
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