固定時(shí)間對原位雜交的影響

                                     作者：馬云 張連國 張輝 周翠玲 劉穎

【摘要】  　　目的 研究組織固定時(shí)間對原位雜交的影響。方法 選擇了18個(gè)固定時(shí)間點(diǎn)的胃癌組織標本，用兩種探針進(jìn)行原位雜交實(shí)驗。結果 固定時(shí)間為8～24 h胃癌組織胞核陽(yáng)性細胞個(gè)數及平均光密度為（84/0.40），明顯高于其它組；固定時(shí)間為6～16 h胃癌組織胞漿陽(yáng)性細胞個(gè)數及平均光密度為（84/0.40），明顯高于其它組。結論 胃癌組織胞核陽(yáng)性最佳固定時(shí)間為8～24 h，胃癌組織胞漿陽(yáng)性最佳固定時(shí)間為6～16 h。 
【關(guān)鍵詞】  固定時(shí)間　原位雜交
　　【Abstract】  Objective  To study the effect of fixing tissue at different time on ISHH.Methods  The experimental tissues fixed with different time were divided into 18 groups, which were examined the mRNA expression of p53，c?myc using ISHH .WTHZ]Results  The number of positive neurons and average optical density value of tissue fixed for 8?24 h were higher than that of others. The number of positive cytoplasm and average optical density value of tissue fixed for 6?16 h were higher than that of others.Conclusion  The best time of fixing tissue neurons is 8?24 h for ISHH,the best time of fixing tissue cytoplasm is 6?16 h for ISHH.
　　【Key words】  time of fixing tissue, ISHH
　　原位雜交（ISHH）屬于固相分子雜交范疇，它是用標記的DNA或RNA為探針在原位檢測組織細胞內特定核酸序列的方法,它不僅保持了細胞固有形態(tài)而且對被測物準確定位。因此，ISHH已被廣泛應用于腫瘤的鑒定、預后分析及相關(guān)學(xué)科的研究之中。研究發(fā)現［1，2］，不同固定劑對原位雜交結果有明顯影響，作者在長(cháng)期的工作中發(fā)現組織固定時(shí)間亦是影響雜交結果的重要因素。本文選擇了18個(gè)固定時(shí)間點(diǎn)的胃癌組織標本，用探針進(jìn)行研究，擬尋找適用的固定時(shí)間段，為提高原位雜交染色方法的準確性和穩定性提供參考依據.
　　1  材料與方法
　　1.1  材料  胃癌標本30例為病理科送檢標本，每例取大小為1 cm×2 cm×0.2 cm組織塊若干固定于多聚甲醛中,固定時(shí)間分別為1、2、4、6、8、12、16、24、48、72 h間及1、2、4、8、12、24、48、72周。P53 、c?myc雜交試劑盒為北京中山公司產(chǎn)品。
　　1.2  方法  原位雜交：切片58 ℃烘烤過(guò)夜,二甲苯脫蠟6 h，梯度酒精水化，DW洗片，PB洗片，0.1DHCL室溫10 min，PB洗片，微波(甘氨酸?鹽酸緩沖液)處理，三乙醇胺?無(wú)水乙酸處理，梯度酒精處理，風(fēng)干后滴加探針42 ℃雜交20 h，42 ℃ 2×SSC洗片，37 ℃ 0.1×SSC洗片，滴加辣根酶標記的Dig抗體37 ℃孵育 2 h，PB洗片,滴加SABC 37℃ 1 h,PB洗片, DAB 顯色，甲基綠或蘇木素復染。
　　1.3  圖像分析  每片組織隨機取10個(gè)陽(yáng)性視野，以測出平均視場(chǎng)（261 632 μm2）內的陽(yáng)性細胞個(gè)數及陽(yáng)性信號的平均光密度。
　　2  結果
    
　　對固定24 h的組織原位雜交方法預實(shí)驗3次，在30例送檢標本選出8例p53 、c?myc雜交均陽(yáng)性標本，對這8例標本的切片按所設計實(shí)驗近一步研究。
    
　　各不同固定時(shí)間組對所測探針均有不同程度的表達見(jiàn)表1。將每個(gè)實(shí)驗時(shí)間點(diǎn)的平均陽(yáng)性細胞數及平均光密度進(jìn)行分析統計，可見(jiàn)：對于胞核呈陽(yáng)性的組織，固定時(shí)間在1～8 h內曲線(xiàn)呈上升趨勢，8～24 h到達峰值，24 h后曲線(xiàn)呈下降趨勢，至100 h后曲線(xiàn)開(kāi)始平緩，由此可知，原位雜交中組織胞核陽(yáng)性最佳固定時(shí)間為8～24 h(圖1)；對于胞漿呈陽(yáng)性的組織，固定時(shí)間在1～6 h內曲線(xiàn)呈上升趨勢，6～16 h到達峰值，16 h后曲線(xiàn)呈下降趨勢，至100 h后曲線(xiàn)開(kāi)始平緩，由此可知，原位雜交中組織胞漿陽(yáng)性最佳固定時(shí)間為6～16 h（圖2）。

表1  不同固定時(shí)間陽(yáng)性細胞個(gè)數及信號的光密度（略）
　　圖1  固定12 h的組織 P53胞核陽(yáng)性(×400)（略）
　　圖2  固定6 h的組織，c?myc胞漿陽(yáng)性(×400)（略）
　　3  討論
    
　　多聚甲醛是通過(guò)醛基與組織內的某些蛋白質(zhì)成分發(fā)生交聯(lián)反應，迅速終止組織內各種酶活性，從而防止細胞自溶，保存細胞的固有形態(tài)。但這樣廣泛的交聯(lián)而掩蓋了特定核酸序列，影響雜交探針與被測基因結合位點(diǎn)的整合。固定時(shí)間適當可應用微波或蛋白酶打開(kāi)交聯(lián)恢復蛋白質(zhì)原有的結構，重新暴露特定核酸序列，但固定時(shí)間太短又導致組織固定不足，使組織中心部位的特定核酸序列溶解、彌散、丟失。一旦固定時(shí)間過(guò)長(cháng)，可使被測基因片段的結合點(diǎn)被牢固封閉，故組織固定時(shí)間是特定核酸序列能否得到良好保存、ISHH能否成功的關(guān)鍵因素。
    
　　本實(shí)驗顯示，固定時(shí)間與原位雜交的結果密切相關(guān)，當組織固定不好(0.5 h固定組)所測探針沒(méi)有表達，固定達1 h后,表達率與時(shí)間開(kāi)始呈正相關(guān).胞漿陽(yáng)性達6 h后到高峰，直至16 h后慢慢下降與時(shí)間呈負相關(guān),胞核陽(yáng)性8 h間后至高峰直至24 h后慢慢下降與時(shí)間呈負相關(guān),這可能與多聚甲醛的固定機制有關(guān)。多聚甲醛溶液實(shí)際上是新鮮配制的甲醛液，甲醛溶解時(shí)大部分分子水合成水化甲醛，分子較大，主要固定組織的表面結構，而小分子的甲醛主要是靠物理擴散，或者其趨脂性滲入到組織中并與其內部含有氨基的物質(zhì)發(fā)生交聯(lián)反應，如果固定時(shí)間太長(cháng)，固定液與組織的交聯(lián)反應過(guò)重，勢必影響實(shí)驗結果。
【參考文獻】
  　�。�1］ 馬云，張燕，孫長(cháng)華,等.固定液對原位雜交的影響［J］.中國組織化學(xué)與細胞化學(xué)雜志,2002,11(3):345.

　�。�2］ 翟為溶,張錦生.現代組織化學(xué)的原理及應用［M］.上海:上�？茖W(xué)技術(shù)文獻出版社,1998:182.

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