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HPLC法測定注射用復方甘草酸苷中甘草酸單苷的含量
摘 要：注射用復方甘草酸苷通常是應用在慢性肝炎和肝功能異常的治療和改善當中，注射用復方甘草酸苷中甘草酸單苷是最為主要的成分，其含量對于藥品的有效會(huì )產(chǎn)生非常明顯的影響，所以其含量的測定就顯得格外的重要。本文主要分析了HPLC法測定注射用復方甘草酸苷中甘草酸單苷的含量，希望能夠給相關(guān)的研究人員提供一定的參考和借鑒。
關(guān)鍵詞：HPLC法;含量測定;甘草酸苷
注射用復方甘草酸苷當中主要有甘草酸單銨鹽、甘草酸和L-鹽酸半胱氨酸三種物質(zhì)，它對慢性肝炎有著(zhù)十分有效的治療效果，而這種藥物的療效和主要成分甘草酸單苷的含量有著(zhù)十分密切的關(guān)系，所以我們在研究的過(guò)程中對注射液中的甘草酸單苷的含量進(jìn)行測定是有著(zhù)十分重大的現實(shí)意義的，在測定的過(guò)程中最為常用的就是HPLC法，以下本文對其進(jìn)行研究。
一、儀器與試藥
高效液相系統(Waters2695泵，Waters2996二極管陣列檢測器，WatersEmpower色譜工作站);乙腈為色譜純。樣品來(lái)源：江蘇揚州中寶藥業(yè)有限公司;樣品批號：20030729、2003073、20030731。參比樣品來(lái)源：日本米諾發(fā)源制藥株式會(huì )社(進(jìn)口注冊證號：H20030185)，參比樣品批號：00344。甘草酸單銨對照品：成都圣諾科技發(fā)展有限公司，HPLC純度99.5%。
二、方法與結果
2.1 色譜條件
色譜柱：KromasilC18，5μ，4.6×250mm，用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，檢測波長(cháng)254nm，流動(dòng)相：乙腈-0.01mol/L磷酸溶液(38∶62)，流速1.0ml/min，在室溫下操作，理論板數按甘草酸苷計算應不低于2000。
2.2 供試品溶液的制備
精確稱(chēng)取本品10mg，將其用適量的注射水溶解，用5ml的胡涉水將其放置在25ml的容量瓶當中，加入適量的流動(dòng)相到刻度的位置，使溶液的濃度能夠達到400μg/ml的溶液，這樣就完成了供試品溶液的制備。
2.3 對照品溶液的制備
精確稱(chēng)取甘草酸單銨對照品適量，將其用注射水進(jìn)行溶解處理，加入適量的流動(dòng)相將溶液制成甘草酸單苷銨，其濃度為530μg/ml的對照溶液。
2.4 線(xiàn)性關(guān)系考察
用天平精確稱(chēng)取甘草酸單苷銨對照品54.6mg，也就是41.2mg的甘草酸單苷對照品，將其放置在容積為50ml的容量瓶當中，用水將其定溶到刻度的位置，分別量取4.0、4.5、5.0、5.5、6.0ml溶液，將其放置在容積為10ml的容量瓶當中。加入適量的流動(dòng)相將其定溶到刻度的位置，每一毫升的溶液當中應分別有329.6μg、370.8μg、412.0μg、453.5μg494.4μg的溶液。分別稱(chēng)取10μl的溶液放入到液相色譜儀當中，對不同溶液的主峰面積進(jìn)行全面的測定，同時(shí)還要將濃度當做是橫坐標，主峰面積當做是縱坐標對其進(jìn)行線(xiàn)性回歸返程的計算，在研究的過(guò)程中發(fā)現甘草酸酐在329.6-494.4μg的范圍之內都能體現出非常好的線(xiàn)性關(guān)系。
2.5 重復性試驗
取線(xiàn)性測定過(guò)程中濃度為420μg/ml的樣品，放入到液相色譜儀當中，連續對其進(jìn)行進(jìn)樣處理6次，檢測到的主峰面積平均值達到了4092，RSD達到;額0.06%這也充分的證明這種檢測方法的重復性非常好。
2.6 穩定性試驗
取線(xiàn)性測定中濃度為412.0μg/ml樣品，將其分別在0、4、8、12、24h進(jìn)行進(jìn)樣處理，對其峰面積進(jìn)行詳細的記錄，峰面積的平均值達到了4084552，RSD達到了0.10%，這一樣品在24小時(shí)之內進(jìn)行測定，RSD數值為0.10%，這也充分的標明樣品在24h之內的穩定性比較強。
2.7 回收率試驗
在研究的過(guò)程中主要要按照高、中、低三個(gè)濃度梯度對其進(jìn)行分類(lèi)處理，同時(shí)在這一過(guò)程中還要精確稱(chēng)取甘草酸單銨對照品10.6、13.25、15.9mg每個(gè)準備3份，將其放置在容積為25ml的容量瓶當中，加入0.2ml的氨試液和少量的水，使藥品充分的溶解，加入適量的水將其稀釋到刻度的位置，此外還要充分的搖勻，將其當做是對照品溶液，嚴格按照甘草酸苷測定的方法對其進(jìn)行處理和操作，對回收率進(jìn)行全面的計算。計算的結果如表1所示：從表1當中我們也可以看出這種方法在回收率方面符合相關(guān)的標準和要求。
表1 甘草酸苷回收率試驗結果
2.8 甘草酸苷的含量測定
精密稱(chēng)取本品10mg，用5ml注射用水溶解，置25ml量瓶中，加流動(dòng)相至刻度，制成甘草酸苷400μg/ml溶液，作為供試品溶液;精密量取供試品溶液2.5ml置10ml量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，制成甘草酸苷100μg/ml溶液，作為預試液。取預試液10μl注入液相色譜儀，調節檢測靈敏度，使主成分峰峰高約為滿(mǎn)量程的80%～90%，再取供試品溶液10μl，注入液相色譜議，記錄色譜圖。另取甘草酸苷對照品，同法測定。按外標法以峰面積計算，即得。依本法測定三批樣品，結果為，其標示量(%)分別為20030729，101.
10;20030730，103.29;20030731，100.02。其參比樣品為103.19。
三、討論
注射用復方甘草酸苷為甘草酸單銨鹽、鹽酸半胱氨酸、甘氨酸制成的注射用粉劑，主要用于治療慢性肝炎，改善肝功能異常，也可用于治療濕疹、皮膚炎，蕁麻疹，目前廣泛地應用于臨床。本文所討論的用高效液相色譜法對注射用復方甘草酸苷中甘草酸單苷含量進(jìn)行測定方法的準確度和精密度良好，專(zhuān)屬性強，能有效控制樣品中甘草酸單銨的含量符合含量測定的方法學(xué)要求，適用于本品的測定。
高效液相色譜的分離過(guò)程。同其他色譜過(guò)程一樣，HPLC也是溶質(zhì)在固定相和流動(dòng)相之間進(jìn)行的一種連續多次交換過(guò)程。它借溶質(zhì)在兩相間分配系數、親和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差別使不同溶質(zhì)得以分離。
開(kāi)始樣品加在柱頭上，假設樣品中含有3個(gè)組分，A、B和C，隨流動(dòng)相一起進(jìn)入色譜柱，開(kāi)始在固定相和流動(dòng)相之間進(jìn)行分配。分配系數小的組分A不易被固定相阻留，較早地流出色譜柱。分配系數大的組分C在固定相上滯留時(shí)間長(cháng)，較晚流出色譜柱。組分B的分配系數介于A(yíng)，C之間，第二個(gè)流出色譜柱。若一個(gè)含有多個(gè)組分的混合物進(jìn)入系統，則混合物中各組分按其在兩相間分配系數的不同先后流出色譜柱，達到分離之目的。
不同組分在色譜過(guò)程中的分離情況，首先取決于各組分在兩相間的分配系數、吸附能力、親和力等是否有差異，這是熱力學(xué)平衡問(wèn)題，也是分離的首要條件。其次，當不同組分在色譜柱中運動(dòng)時(shí)，譜帶隨柱長(cháng)展寬，分離情況與兩相之間的擴散系數、固定相粒度的大小、柱的填充情況以及流動(dòng)相的流速等有關(guān)。所以分離最終效果則是熱力學(xué)與動(dòng)力學(xué)兩方面的綜合效益。
高效液相色譜分析的流程。由泵將儲液瓶中的溶劑吸入色譜系統，然后輸出，經(jīng)流量與壓力測量之后，導入進(jìn)樣器。被測物由進(jìn)樣器注入，并隨流動(dòng)相通過(guò)色譜柱，在柱上進(jìn)行分離后進(jìn)入檢測器，檢測信號由數據處理設備采集與處理，并記錄色譜圖。廢液流入廢液瓶。遇到復雜的混合物分離還可用梯度控制器作梯度洗脫。這和氣相色譜的程序升溫類(lèi)似，不同的是氣相色譜改變溫度，而HPLC改變的是流動(dòng)相極性，使樣品各組分在最佳條件下得以分離。
參考文獻：
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