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論Nogo受體拮抗劑對大鼠急性脊髓損傷的保護作用
摘要： 目的 探討Nogo受體拮抗劑NEP1-40對大鼠脊髓損傷后脊髓功能恢復的影響，為臨床治療急性脊髓損傷提供實(shí)驗依據。方法 健康Wistar大鼠48只隨機分為創(chuàng )傷對照組、NEP1-40治療組。建立大鼠中段胸部脊髓后半部橫切模型。對照組注入生理鹽水，實(shí)驗組采用NEP1-40治療。分別在術(shù)后取材行蘇木精-伊紅染色、免疫熒光染色檢測。術(shù)后第1、3天及1、2、3、4周對動(dòng)物進(jìn)行運動(dòng)功能評分。結果 脊髓損傷3周后，NEP1-40組行為學(xué)評分高于對照組，同時(shí)NeuN/NF-200陽(yáng)性染色亦明顯高于對照組，差異有統計學(xué)意義。結論 NEP1-40治療脊髓損傷能促進(jìn)神經(jīng)元的再生，恢復脊髓功能。
關(guān)鍵詞： 大鼠；脊髓損傷；Nogo受體拮抗劑；再生
脊髓少突膠質(zhì)細胞所分泌的Nogo蛋白是目前已知最強的神經(jīng)軸突生長(cháng)抑制因子，對受損神經(jīng)元再生具有極強的抑制作用［1］。Nogo受體拮抗劑(Nogo extracellular peptide, residues 1-40，NEP1-40)為針對Nogo-66氨基序列設計的Nogo受體(Nogo receptor，NgR)競爭性拮抗劑，能拮抗中樞神經(jīng)抑制因子與NgR的結合，起到促進(jìn)神經(jīng)再生的作用［1-2］。本實(shí)驗主要觀(guān)察NEP1-40對于急性脊髓損傷大鼠運動(dòng)功能的影響及對NF-200表達的影響，并進(jìn)一步探討NEP1-40治療急性脊髓損傷的療效和可能機制。
1 材料和方法
1.1 主要試劑
NEP1-40、兔抗大鼠NeuN 抗體、小鼠抗大鼠NF-200抗體、抗兔IgG-FITC、抗小鼠IgG-RBITC，均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。
1.2 動(dòng)物及分組
健康成年Wistar大鼠48只(由蘇州大學(xué)實(shí)驗動(dòng)物中心提供)， 雌性，體重250～300 g，隨機分為生理鹽水對照組、NEP1-40實(shí)驗組。
1.3 動(dòng)物模型的制作
參照Brosamle等［3］方法制作脊髓半橫斷模型。大鼠經(jīng)腹腔麻醉后固定于立體定位儀上，常規消毒，以第8胸椎(T8)棘突為中心，手術(shù)顯露棘突。手術(shù)顯微鏡下打開(kāi)T8椎板，用刀片做T10脊髓的后半橫斷，損傷深度1.0 mm（橫斷后側和后外側皮質(zhì)脊髓束）。向尾側硬脊膜下置入硬脊膜管（PE-10導管，BD公司），鹽水沖洗切口，固定硬脊膜管，依次縫合，模型制作完成。
生理鹽水對照組通過(guò)置管每天注入生理鹽水20 μl，NEP1-40組每天用微量進(jìn)樣器注入NEP1-40 10 μl(0.4 μg/μl)。每天分早、中、晚3次注射，每次注射完畢后用10 μl生理鹽水沖管，以保證藥物進(jìn)入蛛網(wǎng)膜下腔，連續使用4周。術(shù)后人工擠壓膀胱排尿，每天3次，直至形成排尿反射。術(shù)后3天給予青霉素4萬(wàn)U／只。硬脊膜管外口予無(wú)菌保護，定期換藥。
1.4 標本的收集和處理
所有動(dòng)物均分別于脊髓損傷1、2、3、4周時(shí)用4%多聚甲醛經(jīng)左心室-主動(dòng)脈灌注后取出脊髓組織，灌注液中固定12 h左右，然后放入30%蔗糖溶液中，待組織沉底，冰凍切片機切片，厚度30 μm。
1.5 檢測指標
1.5.1 組織學(xué)檢查
蘇木精-伊紅染色，觀(guān)察脊髓的組織學(xué)改變。
1.5.2 免疫熒光組織化學(xué)雙重標記染色
選取脊髓切片經(jīng)兔抗大鼠NeuN 抗體(1∶500)﹑小鼠抗大鼠NF-200抗體(1∶400)4℃孵育過(guò)夜，再用抗兔IgG-FITC(1∶100)﹑抗小鼠IgG-RBITC (1∶100)37℃孵育1 h，封片后用Leica激光共聚焦掃描顯微鏡觀(guān)察免疫熒光雙標結果。
1.6 運動(dòng)功能評定
采用Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)［4］運動(dòng)評分法。在80 cm×130 cm×30 cm覆蓋有防滑紙板的箱子中，每只實(shí)驗鼠由2名非實(shí)驗人獨自觀(guān)察4 min，對后肢的運動(dòng)功能進(jìn)行評分。0～21分的分級是根據關(guān)節的運動(dòng)、體重的支撐、前后肢的協(xié)調和尾的位置等情況而定。0分代表大鼠后肢無(wú)運動(dòng)，21分表示大鼠后肢運動(dòng)功能正常。BBB評分分別于術(shù)后第1、3、7、14、21、28天進(jìn)行。
1.7 圖像分析
免疫組化染色結果采用德國KONTRONIBAS 2.5全自動(dòng)圖像分析系統，在損傷的頭尾兩側，分別取10個(gè)視野，計算免疫熒光陽(yáng)性神經(jīng)細胞數。
1.8 統計學(xué)處理
SAS 9.0統計軟件對數據進(jìn)行統計學(xué)處理，計量數據用±s表示。2組實(shí)驗大鼠BBB評分，采用具有一個(gè)重復測量的兩因素設計的方差分析，比較不同時(shí)點(diǎn)指標的變化趨勢。2組免疫熒光染色陽(yáng)性反應的比較采用成組設計資料t檢驗。檢驗水準（雙側）：α=0.05。
2 結果
2.1 組織改變
4周時(shí)蘇木精-伊紅染色顯示生理鹽水對照組出現神經(jīng)元固縮、壞死、溶解，細胞體積變��；白質(zhì)中見(jiàn)較多紅細胞滲出，髓鞘腫脹和大量空泡；并有炎性細胞浸潤和膠質(zhì)細胞增生。NEP1-40實(shí)驗組灰質(zhì)腫脹變形、出血、小膠質(zhì)細胞增生和炎性細胞浸潤均較損傷組輕；白質(zhì)點(diǎn)狀出血，白質(zhì)中有較多的正常軸突(圖1)。
2.2 免疫組化
激光共聚焦掃描顯微鏡觀(guān)察到脊髓損傷1、2、3、4周后神經(jīng)元的胞體和細胞核均增大，胞質(zhì)和軸突的NF-200免疫染色為陽(yáng)性，并且與NeuN共定位(圖2)。從NF-200染色陽(yáng)性神經(jīng)元數目的統計分析可見(jiàn)，脊髓損傷3周后NEP1-40實(shí)驗組明顯高于生理鹽水對照組(P
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