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探研富血小板血漿在口腔組織再生中應用的影響因素
富血小板血漿(platelet—rich plasma，PRP)是從20世紀60年代用于止血治療開(kāi)始應用于臨床，1998年Marx首次把PRP與自體髂骨結合應用于下頜骨缺損重建治療中。目前，富血小板血漿定義為利用離心技術(shù)使得少量血漿中自體血小板濃縮，并通過(guò)凝血酶和CaC1，的激活使得血小板中的儀鏈釋放其含有的生長(cháng)因子和黏結蛋白，其同義詞包括血小板凝膠、富生長(cháng)因子血漿、富血小板纖維等。本文對PRP在口腔組織再生中應用的影響因素做一綜述。
1 PRP
1.1 PRP中的生長(cháng)因子和黏結蛋白儲存于血小板a鏈中的生長(cháng)因子包括血小板衍生生長(cháng)因子 (platelet—derived growth factor PDGF)、轉化生長(cháng)因子B(transforming growth factorbeta，TGF.B)、血小板衍生血管生成因子(platelet—derived vascular growth factor，PAGF)、血小板衍生上皮生長(cháng)因子(platelet—derived epidermal growthfactor， PDEGF)、l(insulingrowth factor一1，IGF一1)、血管內皮生長(cháng)因子(vascularendothelial growth factor，VEGF)等。體外實(shí)驗也證實(shí)PRP中還含有3種黏結蛋白， 即纖維蛋白原、纖維連接蛋白、玻璃粘連蛋白，這三種分子可作為骨或結締組織的基質(zhì)。也可作為細胞間的連接分子并以此起著(zhù)骨誘導的作用。
1.2 PRP的制取方法
隨著(zhù)設備和技術(shù)的改進(jìn)，目前各種PRP制取系統都是采用相類(lèi)似的機制。其流程可簡(jiǎn)述為：
�、僖话銖牟∪饲氨垤o脈中采集少量全血(用于牙周組織再生治療的全血量為8～10 mL.用于頜骨重建治療的全血量為8～500 mL)。
�、� 低轉數離心分離：分離出含血小板與紅細胞的上清液及去血小板血漿(platelet poor plasma，PPP)，棄除去血小板血漿。
�、� 高轉數離心分離：紅細胞與比重大的PRP分離，去紅細胞。
�、� 激活并形成凝膠狀：添加自體或異體凝血酶和CaC12.
1.3 組織再生中PRP作用機制
富血小板血漿作用的發(fā)揮在于其所含的大量生長(cháng)因子和蛋白在受區的持續性釋放。這是岡為這些來(lái)自 鏈的多肽分子能夠調控細胞的遷移、附著(zhù)、增殖、分化.并通過(guò)與特定的細胞表面受體結合進(jìn)而促進(jìn)胞外基質(zhì)的堆積，并以此能夠模擬傷口的生理性愈合過(guò)程以及組織的修復過(guò)程嗍�；谶@些理論，PRP能夠促進(jìn)移植物的內環(huán)境穩定性和黏結性，改善骨組織和軟組織的愈合進(jìn)而縮短術(shù)后愈合時(shí)間，此外還可以抵消移植物的吸收。
2 影響PRP在口腔組織再生中應用的因素
盡管理論上認為PRP有利于組織再生.但從現有的相關(guān)文章報道可以發(fā)現，有關(guān)PRP是否有利于口腔組織再生存在很大爭議。在動(dòng)物實(shí)驗中，Jakse等在羊上頜竇提升模型中發(fā)現實(shí)驗組(T)與對照組(C)的組織切片中新骨形成比例不存在顯著(zhù)差異(T：自體髂骨+PPR;C：自體髂骨);而Ohya等 在兔上頜竇提升模型中證實(shí)PRP促進(jìn)骨形成; 國內學(xué)者何家才等在犬下頜骨種植周?chē)睋p模型中也發(fā)現.實(shí)驗組(TCP+PRP)的種植體骨結合率和新骨形成質(zhì)量明顯優(yōu)于對照組(TCP+生理鹽水)。在臨床試驗中，DOri等發(fā)現實(shí)驗組(T)與對照組(C)問(wèn)在臨床附著(zhù)水平上無(wú)顯著(zhù)差異(T：B—TCP+PRP;C：13一TCP)：Piemontese等證實(shí)PRP有助于臨床附著(zhù)水平的增加 通過(guò)對文獻的回顧，我們發(fā)現影響PRP促口腔組織再生實(shí)驗結果差異的因素可以歸納為兩大類(lèi)：第一類(lèi)為與PRP相關(guān)的因素;第二類(lèi)為與實(shí)驗設計相關(guān)的因素。
2.1 與PRP相關(guān)的影響其作用的因素
2.1.1 PRP巾血小板濃度
Marx最早測算出PRP中血小板濃度平均較術(shù)前全血中增加了3.38倍。Weibrich等在比較PRP中血小板不同的濃度對成骨影響的實(shí)驗巾發(fā)現，濃縮度在2～6倍時(shí)實(shí)驗組與對照組在熒光標記的骨量上存在顯著(zhù)差異，但濃縮度在6～11倍時(shí)卻顯示有抑制成骨細胞活性的作用。Weibrich由此也提出當PRP中血小板計數在1×10 / I 時(shí)PRP呈現出最好的生物學(xué)作用。也有學(xué)者提出1x10e/t~L只是PRP促進(jìn)組織愈合的最低適合度。目前，對于組織再生有良好臨床作用的最佳血小板濃縮度仍不是很清楚.不過(guò)已經(jīng)明確的是：PRP中血小板濃度較低其促組織再生作用將欠佳，如果濃度過(guò)高其促組織再生的作用將受抑制 。JlL~b，有學(xué)者認為基于最初全血中血小板數不同，PRP中血小板濃度也將隨著(zhù)變化。但是Weibrich通過(guò)實(shí)驗發(fā)現，血小板數或生長(cháng)因子水平在全血和PRP之間不存在相關(guān)性 。
2.1.2 PRP促組織再生作用的持續時(shí)間
由于血小板的半衰期僅為8～12 d，有學(xué)者提出PRP在早期有促進(jìn)骨形成的作用，但隨時(shí)間推移這種作用將會(huì )減弱或者消失[17.181：有實(shí)驗結果支持此觀(guān)點(diǎn)：@Thor等 1有關(guān)上頜竇提升術(shù)骨移植的成骨性實(shí)驗發(fā)現，術(shù)后3個(gè)月PRP組與對照組在新骨形成量上存在明 差異.但在術(shù)后6個(gè)月兩組問(wèn)就已無(wú)顯著(zhù)差異;⑦Harnack等[羽有關(guān)PRP在牙周手術(shù)中應用的隨機對照實(shí)驗發(fā)現.傷口愈合指數在術(shù)后3 d時(shí)比較高，但從術(shù)后2周起開(kāi)始下降。
2.1.3 制取PRP 的不同方法
早在2001年Zimmermann等通過(guò)實(shí)驗發(fā)現，PRP中血小板濃度隨不同制取方法而存在明顯差異。Weibrich等f(wàn)6l認為目前PRP制取方法大致分為梯度密度細胞分離法和‘uffv coat’(白細胞層)法，并指出與 uffv coat’(白細胞層)法相比梯度密度細胞分離法產(chǎn)生的血小板數多，生長(cháng)因子水平高。Weibrich等 比較了PCCS (濃縮血小板采集系統，platelet concentrationc0liection system)與Curasan(eurasan PRP kit)兩種不同的PRP制取系統，并發(fā)現PCCS系統產(chǎn)生的血小板數更多，TGF—B與IGF I的濃度更高。
2.1.4 PRP的激活物—— 凝血酶
目前，用于PRP激活的凝血酶主要為兩種來(lái)源：一種為自體獲取的人凝血酶：另一種為異種來(lái)源的凝血酶，多為牛凝血酶。Su等 分別用人凝血酶和牛凝血酶來(lái)制備PRP膠.發(fā)現使用人凝血酶制成的PRP其PDGF和TGF濃度高于用牛凝血酶制成的。
2.1.5 PRP生長(cháng)兇子的雙重性作用
PDGF和TGF.B都具有刺激或抑制成骨細胞的作用。此外由于PRP內含多種多肽類(lèi)因子，每個(gè)因子對同一組織都有著(zhù)不同的作用或應答，并相互作用，進(jìn)而形成多種信號分子級聯(lián)表達途徑，最終導致基因的表達和蛋白形成。在一動(dòng)物模型中，雖然TGF.p在PDGF的激活下被釋放，但在組織學(xué)中并沒(méi)有發(fā)現纖維組織的形成。
2.1.6 其他再生材料的影響
在口腔骨組織工程中，骨替代材料分為自體骨、同種異體骨、異種骨、異質(zhì)骨替代材料。其中自體骨是通過(guò)骨傳導(osteoconductive)和成骨來(lái)促進(jìn)骨愈合，異體骨是通過(guò)骨誘導性fosteoinductive)來(lái)促進(jìn)骨形成，異質(zhì)骨替代材料是通過(guò)骨傳導性來(lái)促進(jìn)骨愈合。骨傳導性材料通過(guò)支架的作用來(lái)支持自體新骨組織生成并逐漸被替代，而骨替代性材料通過(guò)材料或生長(cháng)因子刺激宿主再生來(lái)恢復缺失閉。目前，PRP已與上述各種骨替代材料結合應用于口腔組織再生中。
但有學(xué)者指出：PRP不具有骨誘導性，僅有骨傳導潛能 ，只有當宿主重要活細胞(成骨細胞和骨細胞)存在時(shí)PRP才能促進(jìn)新骨形成舊。有學(xué)者發(fā)現，當自體骨不存在或移植材料體積過(guò)大時(shí)，PRP就無(wú)法產(chǎn)生有效的刺激作用[281。這些似乎可以解釋PRP與無(wú)活力移植材料結合無(wú)明顯促骨形成作用。PRP中的生長(cháng)因子對巨噬細胞和單核細胞有趨化作用，實(shí)驗證實(shí)當上述兩種細胞在宿主區過(guò)多時(shí)會(huì )引發(fā)宿主區組織感染，進(jìn)而導致B.TCP的早期吸收 。另一動(dòng)物實(shí)驗發(fā)現骨傳導性替代材料可阻礙再生區空間從而阻止牙周組織再生。
2.2 與實(shí)驗設計相關(guān)的影響PRP作用的因素
目前，有關(guān)PRP在口腔組織再生中作用的實(shí)驗部分存在著(zhù)設計上的缺陷，這些設計缺陷可能會(huì )掩蓋了PRP在組織再生中的角色。這些與實(shí)驗設計有關(guān)的因素包括病人情況、術(shù)后隨訪(fǎng)期、檢查指標等。
2.2.1 人選的病人情況
有無(wú)影響實(shí)驗的系統病史，口腔衛生情況，有無(wú)吸煙史，骨缺損的類(lèi)別，疾病的嚴重程度等都會(huì )影響實(shí)驗的結果。在牙周治療中，垂直骨缺損越多，臨床附著(zhù)水平增加也越多。一些實(shí)驗證實(shí)，經(jīng)牙周常規和再生治療后菌斑控制是影響牙周組織愈合的重要因素之一。
2.2.2 術(shù)后隨訪(fǎng)期
有兩個(gè)有關(guān)白體髂骨與PRP結合運用的實(shí)驗.以術(shù)后4個(gè)月為隨訪(fǎng)期的實(shí)驗得出PRP有利于成骨，以術(shù)后6個(gè)月為隨訪(fǎng)期的實(shí)驗卻得出相反結果。這可能與PPR的骨傳導性發(fā)揮在成骨早期有關(guān)。但是，長(cháng)期的評估是更有利于觀(guān)察實(shí)驗的臨床穩定性。
2.2.3 實(shí)驗的檢查指標
目前.有關(guān)上頜竇的實(shí)驗主要為受植區骨組織學(xué)檢查，檢驗指標多為松質(zhì)骨體積(trabecular bone volume，TBV)、骨體積比、新骨形成比：影像學(xué)檢查，指標多為骨密度值。有關(guān)牙周再生的實(shí)驗主要為臨床檢測，檢驗指標多為臨床附著(zhù)水平(clinical attachment level，CAL)、牙齦退縮(gingival recession， GR)、牙周袋探診深度(pocketdepth PD) 在一篇有關(guān)PRP與脫鈣凍干骨移植物結合治療牙周骨內缺損的RCT(隨機雙盲對照)試驗中，作者發(fā)現在術(shù)后12個(gè)月CAL與PD在實(shí)驗組(脫鈣凍干骨+PRP)與對照組(脫鈣凍干骨+生理鹽水)間存在顯著(zhù)差異，但GR在兩組問(wèn)無(wú)顯著(zhù)差異。
我們知道，臨床附著(zhù)水平的增加不僅與骨形成有關(guān)也與纖維結締組織以及結合上皮形成有關(guān)。顯然選用CAL做指標時(shí)，無(wú)法辨別附著(zhù)水平的增加有多少是由于骨形成的，又有多少是由于結締組織形成的。Plaehokova等指出組織學(xué)評價(jià)是對于檢驗PRP成骨作用所必須的。
2.2.4 其他與實(shí)驗設計相關(guān)因素
實(shí)驗組與對照組的設計，樣本量的大小也可能影響實(shí)驗的結果。Gunsolley等 指出，在牙周骨內缺損再生治療的實(shí)驗中每組樣本量至少為30人。樣本隨機分配不充分，分配隱藏不足或者雙盲不完全的小樣本實(shí)驗可能會(huì )擴大干擾效果 。
3 結論
本文綜述了目前影響PRP在口腔再生實(shí)驗中結果不相一致的相關(guān)因素，發(fā)現這些影響因素既有PRP自身的因素也有與實(shí)驗設計有關(guān)的因素。通過(guò)這些因素的分析.我們認為只有在完全隨機對照雙盲的實(shí)驗條件下，并統一與PRP相關(guān)的非生物性因素，才可能發(fā)現PRP在口腔再生實(shí)驗中真正的作用，以期有助于PRP在臨床的應用。
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