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淺談化學(xué)消毒的中和劑對水中內毒素活性檢測的影響論文
細菌內毒素又稱(chēng)脂多糖，是革蘭氏陰性細菌和某些藍藻的細胞壁組分物質(zhì)，活菌釋放較少，主要由菌體解體后釋放. 內毒素是常見(jiàn)的外源性致熱原，屬于強免疫刺激因子，具有廣泛的生物活性，與多種人類(lèi)疾病密切相關(guān). 機體對內毒素反應極為敏感，Elin 等報道使用0. 1 ～ 0. 5 ng·kg - 1 內毒素進(jìn)行體內注射可以引起人體的發(fā)熱反應. 血液暴露是內毒素的主要暴露途徑. 為了保證與血液接觸的藥品、醫療器械及醫療用水的安全性，內毒素檢查一直被認為是醫藥行業(yè)的重要檢驗項目. 目前內毒素的法定檢測方法是鱟試驗，其機制是鱟血中阿米巴細胞與內毒素發(fā)生一系列酶促反應導致凝集反應. 光度法鱟試驗( 濁度法和顯色法) 是內毒素的定量測試方法，2005 年中國藥典正式將光度法收錄. 鱟試驗屬于生物毒性測試，不是精確的分析方法，干擾因素很多. 藥典規定鱟試驗中常用的干擾去除方法是對樣品多倍稀釋?zhuān)⒖刂萍訕嘶厥章试?0% ～ 200%之內. 但是，對于嚴重干擾的樣品經(jīng)多倍稀釋后內毒素活性降低，有時(shí)不能達到測試劑的最低檢測限，難以保證合適的回收率. 因此，在鱟試驗前不僅需要確定樣品含有的干擾因素，還需要避免添加嚴重干擾鱟試驗的物質(zhì). 另外，在采用光度法鱟試驗時(shí)，還應避免添加影響光密度值的物質(zhì).
近年來(lái)細菌內毒素的研究領(lǐng)域從醫藥行業(yè)逐漸外展，水體環(huán)境內毒素所致潛在的健康風(fēng)險已經(jīng)引起越來(lái)越多關(guān)注. 當水中微生物增殖或者藍藻暴發(fā)，菌體死亡或者經(jīng)過(guò)消毒處理后釋放的大量?jì)榷舅�，可以通過(guò)呼吸和胃腸暴露等途徑危害機體健康.在水消毒工藝方面，不同的消毒工藝、消毒劑量和反應時(shí)間都會(huì )對內毒素的釋放和控制效果帶來(lái)影響. 在評價(jià)化學(xué)消毒措施對內毒素釋放的控制效果時(shí)，必須先采用中和劑來(lái)去除樣品中殘留消毒劑，因此應該避免化學(xué)消毒的中和劑對鱟試驗結果的干擾. 目前環(huán)境領(lǐng)域和醫療領(lǐng)域常見(jiàn)化學(xué)消毒的中和劑有多種，如組氨酸、甘氨酸、抗壞血酸、吐溫80、亞硫酸鈉和硫代硫酸鈉等. 這些中和劑對所試微生物無(wú)抑制或殺滅作用，對培養基的營(yíng)養成分無(wú)破壞作用，但是對鱟試驗檢測結果的干擾情況尚不清晰.本研究采用動(dòng)態(tài)濁度鱟試驗，探討常見(jiàn)的中和劑單獨使用時(shí)對內毒素活性定量檢測結果的干擾情況，旨在選擇適用于內毒素檢測的中和劑，并確定合適的使用濃度范圍.
1 材料與方法
1. 1 玻璃器皿
無(wú)熱原稀釋試管( 15 mm × 100 mm) 、無(wú)熱原反應試管( 8 mm × 75 mm) 和無(wú)熱原移液器吸頭購買(mǎi)自湛江安度斯生物公司. 其他玻璃器皿經(jīng)鉻酸浸泡24 h，熱自來(lái)水沖洗，超純水沖洗，馬弗爐干烘350 ～400℃ 2 h 去除熱原.
1. 2 儀器與試劑
內毒素定量檢測采用ATI320-06 動(dòng)態(tài)試管儀及配套軟件( Lab Kinetic 公司，英國) . pH 值測定采用Pb-21 酸度計( Sartorius 公司，德國) . Mill-Q 純水機( Millipore 公司，美國) . 另外，還需要渦旋混合器、馬弗爐、移液器. 動(dòng)態(tài)濁度法鱟試劑( 最低檢測限0. 03 EU·mL - 1 ) 、無(wú)熱原檢查用水( < 0. 003EU·mL - 1 ) 和無(wú)熱原Tris-HCl( pH 7. 4) 緩沖溶液購買(mǎi)自湛江安度斯生物公司. 內毒素工作標準品( control standard endotoxin，CSE，批號150601，每支90 EU) 購買(mǎi)自中國藥品生物制品檢定所( 北京) .生物化學(xué)試劑如抗壞血酸、Na2SO3和Na2S2O3為分析純，組氨酸、甘氨酸和吐溫80 購買(mǎi)自Sigma公司.
1. 3 動(dòng)態(tài)濁度法鱟試驗檢測內毒素活性
采用動(dòng)態(tài)濁度鱟試驗定量檢測內毒素活性，將0. 1 mL 鱟試劑加入反應管，加入0. 1 mL 樣品混合均勻，立即放入ATI320-06 動(dòng)態(tài)試管儀進(jìn)行檢測.樣品和鱟試劑在37℃ 溫育條件下發(fā)生凝集反應，ATI320-06 動(dòng)態(tài)試管儀及軟件生成每個(gè)樣品的反應動(dòng)態(tài)曲線(xiàn)，記錄反應試管在波長(cháng)405 nm 處達到95%透光率的達限時(shí)間. 樣品的達限時(shí)間和所含內毒素活性負相關(guān)，根據標準曲線(xiàn)來(lái)確定樣品內毒素活性. 每個(gè)樣品采用2 個(gè)平行樣，并以0. 1EU·mL - 1CSE 溶液作為陽(yáng)性對照，記錄回收率、稀釋倍數、達限時(shí)間等其他參數. 樣品測試3 次取均值. 試驗結果應滿(mǎn)足以下條件: ① 標準曲線(xiàn)中陰性對照的達限時(shí)間長(cháng)于最低活性( 0. 031 25EU·mL - 1 ) 的達限時(shí)間. ② 標準曲線(xiàn)相關(guān)系數R 大于0. 98. ③ 平行樣的變異系數不得大于10%. ④根據藥典規定，加標回收率在50% ～ 200% 之間認為稀釋倍數合適，沒(méi)有明顯的干擾.
1. 4 內毒素檢測的干擾試驗
( 1) CSE 溶液的配制打開(kāi)CSE( 每支90EU) ，向安瓿瓶?jì)燃? mL 無(wú)熱原檢查用水配制成90EU·mL - 1的CSE 溶液，密封后采用渦旋混合15min. 將CSE 溶液轉移至無(wú)熱原玻璃容器，加無(wú)熱原檢查用水稀釋成0 ～ 2 EU·mL - 1的CSE 溶液.
( 2) 0 ～ 1. 0%濃度的中和劑對鱟試驗的影響
采用無(wú)熱原檢查用水，將組氨酸、甘氨酸、抗壞血酸、吐溫80、亞硫酸鈉( 堿性) 和硫代硫酸鈉配制成濃度0、0. 5%、1. 0%、2. 0%、5. 0%和10. 0%的中和劑溶液. 此外，采用無(wú)熱原Tris-HCl( pH 7. 4) 緩沖溶液配制濃度分別為0、0. 5%、1. 0%、2. 0%、5. 0%和10. 0%的亞硫酸鈉( 中性) 溶液. 將已配制的不同濃度中和劑溶液按1∶ 9的比例添加至0 ～ 2EU·mL - 1的CSE 溶液中，檢測組氨酸、甘氨酸、抗壞血酸、吐溫80、亞硫酸鈉( 堿性) 、亞硫酸鈉( 中性) 和硫代硫酸鈉濃度分別在0、0. 05%、0. 1%、0. 2%、0. 5%和1. 0%情況下內毒素活性的變化.
( 3) 0 ～ 5. 0%濃度的硫代硫酸鈉對鱟試驗的影
響將硫代硫酸鈉加無(wú)熱原檢查用水溶解，配制成0、2. 5%、5. 0%、10. 0%、15. 0%、20. 0% 和25. 0%的硫代硫酸鈉溶液. 將已配制的硫代硫酸鈉溶液按1∶ 4的比例添加至0 ～ 2 EU·mL - 1 的CSE 溶液中，檢測硫代硫酸鈉濃度分別在0、0. 5%、1. 0%、2. 0%、3. 0%、4. 0%和5. 0%情況下內毒素活性的變化.
2 結果與分析
2. 1 常用的有機類(lèi)中和劑對鱟試驗結果的影響
組氨酸、甘氨酸、抗壞血酸和吐溫80 是常用的有機類(lèi)中和劑，在0 ～ 1. 0% 的濃度范圍對動(dòng)態(tài)濁度法鱟試驗的干擾結果. 結果表明，甘氨酸對內毒素活性的檢測未見(jiàn)明顯干擾，組氨酸、抗壞血酸和吐溫80 對檢測結果均有不同程度的影響，干擾程度詳. 其中，0～ 1. 0%濃度的組氨酸對內毒素活性的定量檢測引起強烈的增強效果; 抗壞血酸引起顯著(zhù)的抑制效果; 吐溫80 引起明顯的抑制作用. 甘氨酸和組氨酸等氨基酸類(lèi)用來(lái)中和醛類(lèi)消毒劑. 由于組氨酸是類(lèi)內毒素物質(zhì)，可以引起內毒素的聚集和吸附，嚴重影響光度法鱟試驗的光度值，導致檢測結果的增強. 當組氨酸濃度從0 提高至0. 05% 時(shí)，檢測結果從初始內毒素活性0. 38EU·mL - 1 增高至0. 95 EU·mL - 1，增強率達到150%; 當組氨酸濃度從0. 05% 提高至0. 5% 時(shí)，內毒素活性提高至3. 30 EU·mL - 1，增強率達到768%. 0 ～ 1. 0% 濃度的甘氨酸對鱟試驗結果基本無(wú)明顯干擾. 檢測結果表明當甘氨酸濃度從0 提高至1. 0%時(shí)，初始內毒素活性1. 22 EU·mL - 1 增高至1. 39 EU·mL - 1，增強率僅為14%. 但是，甘氨酸和戊二醛的中和產(chǎn)物顯黃色，會(huì )對光度法鱟試驗( 濁度法和顯色法) 產(chǎn)生嚴重干擾，因此在光度法鱟試驗中，甘氨酸不適于做戊二醛的中和劑使用. 吐溫80 是常用的中和劑，可以和卵磷脂配伍用于清除吸附力較強的離子型消毒劑如季銨鹽類(lèi)和酚類(lèi). 0～ 1. 0%濃度的吐溫80 對內毒素檢測引起明顯的抑制效果. 當吐溫80 濃度從0 提高至1. 0% 時(shí)，檢測結果從初始內毒素活性1. 18 EU·mL - 1 降低至0. 69EU·mL - 1，抑制率為41%. 抗壞血酸是常用的抗氧化劑，可以用作鹵素消毒的中和劑. 0 ～ 1. 0% 濃度的抗壞血酸對鱟試驗結果引起顯著(zhù)的抑制效果. 當抗壞血酸濃度從0% 提高至0. 05%，檢測結果從初始內毒素活性1. 23 EU·mL - 1 降低至0. 70EU·mL - 1，抑制率達到43%; 當抗壞血酸濃度提高至1. 0% 時(shí)，內毒素活性降低至0. 34 EU·mL - 1，抑制率達到72%. 抗壞血酸的酸性強，向樣品中添加會(huì )導致內毒素的酸解或者對鱟試劑酶活性造成破壞，抑制鱟試驗的反應并影響檢測結果.
2. 2 常用無(wú)機類(lèi)中和劑對鱟試驗結果的影響
亞硫酸鈉和硫代硫酸鈉是常用的無(wú)機類(lèi)中和劑，其在0 ～ 1. 0%的濃度范圍對動(dòng)態(tài)濁度法. 亞硫酸鈉是鹵素和醛類(lèi)消毒劑的中和劑，由于亞硫酸鈉的堿性強，使用時(shí)分為堿性和中性?xún)煞N情況. 0 ～ 1. 0%濃度的亞硫酸鈉( 堿性) 對內毒素檢測有明顯的增強效果. 當亞硫酸鈉( 堿性) 濃度從0 提高至1. 0%時(shí)，檢測結果從初始內毒素活性1. 08 EU·mL - 1增高至1. 50 EU·mL - 1，增強率為39%. 亞硫酸鈉( 堿性)對鱟試驗有增強效果，這是因為鱟試劑中含有一定數量的Ca2 + 和Mg2 + 用來(lái)保持試劑的分散性，OH- 的增多會(huì )影響Ca2 + 和Mg2 + 的狀態(tài)，導致鱟試劑分散性差，引起反應產(chǎn)物聚集導致增強結果. 0 ～ 1. 0% 濃度的亞硫酸鈉( 中性) 對內毒素檢測引起顯著(zhù)的抑制作用. 亞硫酸鈉( 中性) 濃度從0 提高至1. 0%時(shí)，檢測結果從初始內毒素活性1. 08 EU·mL - 1 降低至0. 38EU·mL - 1，抑制率為65%. 雖然亞硫酸鈉在調節pH值至中性后，可以消除水樣的堿度帶來(lái)的干擾，但是添加的H+ 和SO2 -3生成的HSO-3破壞鱟試劑中酶的活性，對鱟試驗有抑制效果. 硫代硫酸鈉是鹵素類(lèi)消毒劑、汞制劑及過(guò)氧乙酸等的中和劑. 0 ～1. 0%濃度的硫代硫酸鈉對鱟試驗結果基本無(wú)明顯干擾，當硫代硫酸鈉濃度從0 提高至1. 0%時(shí)，內毒素活性從初始值1. 08 EU·mL - 1降低為1. 01 EU·mL - 1，抑制率僅為6. 5%. 但是當硫代硫酸鈉濃度提高至1. 0% ～5. 0%時(shí)，對內毒素檢測結果有明顯的抑制效果. 因此，低濃度的硫代硫酸鈉溶液適于在鱟試驗之前作為消毒劑的中和劑，但是濃度應該控制在0. 5%以?xún)?
3 結論
( 1) 在0 ～ 1. 0% 濃度范圍內，除甘氨酸和硫代硫酸鈉之外，組氨酸、抗壞血酸、吐溫80 和亞硫酸鈉( 中性和堿性) 對內毒素檢測結果均有不同程度的干擾.
( 2) 組氨酸對內毒素活性的定量檢測有強烈的增強效果; 抗壞血酸引起顯著(zhù)的抑制效果; 吐溫80引起明顯的抑制效果; 亞硫酸鈉( 堿性) 引起明顯的增強效果; 亞硫酸鈉( 中性) 有顯著(zhù)的抑制效果.
( 3) 此外，0 ～ 1. 0% 濃度的甘氨酸對內毒素檢測基本無(wú)明顯干擾，但是甘氨酸和戊二醛的中和產(chǎn)物呈黃色，當作為戊二醛的中和劑使用時(shí)會(huì )對光度法鱟試驗的結果產(chǎn)生干擾. 0 ～ 1. 0%濃度的硫代硫酸鈉對鱟試驗結果基本無(wú)明顯干擾，但是高濃度的硫代硫酸鈉( 1. 0% ～ 5. 0%) 會(huì )對鱟試驗引起明顯的抑制效果.
( 4) 與組氨酸、甘氨酸、抗壞血酸、吐溫80 和亞硫酸鈉相比，硫代硫酸鈉更適合在鱟試驗之前用作中和劑，但是濃度應控制在0. 5% 范圍以?xún)? 此外，有些消毒措施不適合選擇硫代硫酸鈉作為中和劑，需進(jìn)一步篩選出對鱟試驗無(wú)明顯干擾的其他中和劑，避免使用組氨酸、抗壞血酸、吐溫80 和亞硫酸鈉這類(lèi)對鱟試驗有干擾的中和劑.
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