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研非復制性腺病毒攜帶AT2
0 引言
1975 年Kohler 和Milstein 首先報道，用細胞雜交技術(shù)，使經(jīng)綿羊紅細胞(SRBC)免疫的小鼠的脾細胞，與小鼠的骨髓瘤細胞融合，并由此創(chuàng )建了第一個(gè)B 細胞雜交瘤細胞株，獲得了抗SRBC 的單克隆抗體。他們首先創(chuàng )立了將能分泌特異性抗體的B 淋巴細胞同無(wú)限繁殖的骨髓瘤細胞融合技術(shù)，為單克隆抗體的制備奠定了基礎。這是免疫學(xué)，乃至醫學(xué)史上的一個(gè)里程碑。
單克隆抗體以特異性高、性質(zhì)均一和針對特定靶點(diǎn)定向制備等諸多優(yōu)點(diǎn)而廣泛應用于各種疾病的治療，特別是在腫瘤領(lǐng)域內的應用備受關(guān)注。美國FDA 先后批準了10 多個(gè)用于治療腫瘤的抗體藥物，都是全長(cháng)抗體。雖然單克隆抗體在腫瘤治療中發(fā)揮了重要的作用，但全長(cháng)單克隆抗體治療腫瘤成本太高：治療腫瘤的抗體需要量極多且純度要求高，目前的生物制藥工藝難以滿(mǎn)足市場(chǎng)的需求，大規模、高密度的哺乳動(dòng)物細胞培養技術(shù)是目前國際上的一大難題，這些均導致高生產(chǎn)成本及昂貴的價(jià)格，一般患者難以承受。
因此，本課題的目的是利用非增殖腺病毒作為載體攜帶全長(cháng)抗體基因在體內表達全長(cháng)抗體，這樣可以避免在體外用哺乳動(dòng)物細胞表達抗體，以及純化等復雜而且昂貴的規程。AT2是一個(gè)對腫瘤有明顯療效的抗EGFR 單克隆抗體Cetuximab。由于EGFR 在很多腫瘤中都有過(guò)量表達，在腫瘤的發(fā)生、生長(cháng)、抗藥性和轉移性中都起到了重要的作用。Cetuximab 對過(guò)量表達EGFR 的腫瘤有良好的治療作用，現已被批準用于頭頸癌、直腸癌和肺癌的治療，無(wú)論是單獨使用還是與其它藥物聯(lián)合應用都有很好的效果，只有很小的副作用，出現嚴重反應的概率不及萬(wàn)分之一。Cetuximab 單抗應用其它腫瘤治療的研究也在大力的開(kāi)發(fā)中，在腫瘤的治療中有很大應用前景，但是由于其生產(chǎn)成本過(guò)高，國內普通患者難以承擔，而抗體基因治療正好解決了這個(gè)問(wèn)題。本研究根據人體內密碼子的偏愛(ài)性選擇修改了部分氨基酸密碼子，構建了修改密碼子后的重組腺病毒載體。體外實(shí)驗表明，通過(guò)修改密碼子后提高了抗體的表達量，通過(guò)Western 和IFN 實(shí)驗檢驗，無(wú)論修改密碼子與否，重組腺病毒在293 細胞中表達的抗體與商品化的 Cetuximab 單抗相近的特性，分子量大小一致，與抗原EGFR 有很好的結合，說(shuō)明我們構建的載體表達的抗體是有活性的。
1. 材料和方法
1.1 材料5 型腺病毒骨架質(zhì)粒pBHGE3（加拿大Microbix Biosystems 公司），人表皮鱗癌細胞株A431、SK-Br-3 細胞和人胚胎腎細胞293 細胞(購于A(yíng)TCC)，DMEM 細胞培養液，胎牛血清FBS(購于GIBCO 公司),穿梭載體pDC339 (本實(shí)驗室構建)。引物和抗體基因由上海生工公司合成。
1.2 實(shí)驗方法
1.2.1 細胞培養A431 細胞、SK-Br-3 細胞和293 細胞在5%CO2，37℃ 條件下培養，培養液為含10%FBS的DMEM。
1.2.2 構建攜帶抗體基因重組
腺病毒載體我們首先分別合成修改密碼子前后的AT2 抗體基因的輕鏈及重鏈，且在輕鏈及重鏈前面各自合成抗體的信號肽基因，用IRES 元件連接抗體的輕鏈和重鏈基因，以實(shí)現AT2 抗體的重鏈和輕鏈的平衡性及完整性，經(jīng)PCR 引入酶切位點(diǎn)后，逐步把重輕鏈基因裝入載體pDC339 中。
經(jīng)過(guò)酶切和 PCR 鑒定后測序。PCR 鑒定穿梭載體pDC339-AT2 和pDC339-NAT2(修改過(guò)密碼子)重、輕鏈的引物分別是GT340+GT341（輕鏈）、GT342+ GT343（重鏈）和ATNL-1+ ATNL-4（輕鏈）、 ATNH-1 +ATNH-4（重鏈）。測序正確后的穿梭載體與5 型腺病毒骨架質(zhì)粒pBHGE3 利用轉染試劑Lipofectamine 2000 共轉染至293 細胞，通過(guò)同源重組的方法獲得攜帶目的基因的重組病毒。共轉染后9～14 d 出現病毒空斑，經(jīng)過(guò)PCR 法鑒定目的基因正確后，得到表達Cetuximab 抗體的重組腺病毒載體Ad5-AT2 和Ad5-NAT2。簡(jiǎn)化示意圖如下：
1.2.3 病毒擴增和純化
病毒滴度測定重組腺病毒載體Ad5-AT2 和Ad5-NAT2 經(jīng)鑒定正確后進(jìn)行大擴后，用HPLC 法在純化車(chē)間純化，應用50%組織培養感染劑量法(TCID50)測定病毒滴度。
1.2.4 重組腺病毒表達的抗體檢測
實(shí)驗鋪板 293 細胞，培養過(guò)夜后，按MOI=10 分別加入兩個(gè)病毒，收上清用于抗體的檢測實(shí)驗。用雙夾心ELISA 法測定抗體的表達量；用Western 鑒定其與商品化的Cetuximab 單抗比較分子量大��；間接免疫熒光實(shí)驗是根據抗原抗體反應的原理，用熒光標記抗體作為分子探針，檢查抗體Cetuximab 與A431 細胞膜上的抗原EGFR 結合的特異性，同時(shí)用EGFR 陰性的SK-Br-3 細胞做陰性對照。
2. 結果
腺病毒穿梭載體pDC339-AT2 和pDC339-NAT2 的酶切和PCR 鑒定結果。
應用50%組織培養感染劑量法(TCID50)測定病毒滴度，Ad5-AT2 和Ad5-NAT2 的病毒滴度分別是1.2×1010pfu/ml，1.0×1010pfu/ml。
用雙夾心 ELISA法測定病毒抗體的表達量：Ad-AT2 與Ad-NAT2 相比的表達量分別是：
25.2±5ng/ml 和285.3±5ng/ml，通過(guò)修改密碼子較大的提高了抗體的表達量。
重組腺病毒Ad-AT2、Ad339-NAT2 按MOI＝10 轉染細胞株293，感染72 小時(shí)后用Western Blot 方法檢測細胞上清中Cetuximab 抗體與商品化的抗體比較分子量大小。查看EFNB2與精神分裂癥樣本的關(guān)聯(lián)。
3 討論
治療各種疾病、頑癥中有巨大的優(yōu)勢，但是由于其自身的某些性質(zhì)，加上目前我們的生產(chǎn)抗體的技術(shù)和工藝，限制了抗體的應用。在當前的生產(chǎn)抗體的工藝比較復雜，需要綜合多項技術(shù)，工藝和技術(shù)都被少數公司壟斷，而且抗體的需要量也在增大，最后導致抗體的治療成本極高。
為了降低成本和提高抗體治療效果，基因治療是一種新型有效的手段，我們可以通過(guò)把全長(cháng)抗體基因裝入載體，通過(guò)載體帶進(jìn)體內，是抗體在體內表達。這樣既可以免去體外生產(chǎn)抗體眾多復雜的過(guò)程，降低成本，又可以使抗體更好的在體內持續作用，更好的到達組織。
因此，如何找到一個(gè)安全的，有效的載體是關(guān)鍵。腺病毒成為一個(gè)重要的載體，由于我們對其研究得比較清楚，我們對其進(jìn)行改造，刪除負責病毒復制的E1A 區以及其它多余的區域。
腺病毒作為載體應用于基因治療中有眾多優(yōu)點(diǎn)，在目前的條件下，腺病毒載體相對于其它載體，更適合作為基因治療的載體。
根據密碼子的偏愛(ài)性，我們收集了高表達的氨基酸密碼子，修改了部分抗體基因的密碼子，以此來(lái)提高抗體的表達量。經(jīng)Western 鑒定和IFN 實(shí)驗證明腺病毒載體表達的抗體是完整和有活性的，特異性也很好，可以應用下一步的治療研究。
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