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鼠同種異體腎上腺細胞腎被膜下移植
鼠同種異體腎上腺細胞腎被膜下移植
【摘要】 目的：觀(guān)察大鼠同種異體腎上腺細胞腎被膜下移植治療腎上腺皮質(zhì)功能不全的可行性，并提供一種有效的移植途徑。
方法：成年雄性Wistar大鼠40只，分為對照組(雙側腎上腺切除術(shù))，實(shí)驗組(雙側腎上腺切除+腎被膜下細胞移植術(shù))，假手術(shù)組(僅暴露腎臟后關(guān)閉切口)，觀(guān)察大鼠體內皮質(zhì)酮、醛固酮激素質(zhì)量濃度的動(dòng)態(tài)變化及局部新生組織的血管生長(cháng)和淋巴、巨噬細胞的浸潤情況。
結果：移植的腎上腺細胞可存活并能部分替代大鼠分泌皮質(zhì)酮、醛固酮的功能。
術(shù)后6周局部可見(jiàn)血管長(cháng)入，無(wú)明顯炎性細胞浸潤。
結論：植入腎被膜下的腎上腺細胞能存活并有分泌功能，且腎被膜下移植為腎上腺細胞提供良好的移植床。
【關(guān)鍵詞】 大鼠;腎上腺細胞;腎被膜下;異體移植
[Abstract]Objective： To observe the outcome of allotransplantation of adrenocortical cells in subrenal capsule in rats to treat insufficiency of adrenocortical function， and to apply an effective way of transplants.
Method： Cultured adrenocortical cells in vitro had transplanted into subrenal capsule with bilaterally adrenalectomized allorats， the plasma corticosterone and aldosterone level， graft survival and pathology were compared respectively.
Results： The transplanted adrenocortical cells could survive and partially represent functions of adrenal glomerulosa zona and fasciculate zona.
The plasma corticosterone and aldosterone levels were 80%、30% of sham_operated group eight weeks after operation respectively， the pale yellow tissue was visible in subrenal capsule and had been invaded by prominent blood vessels， the tissue had not been invaded by inflammatory cells.
Conclusion： Adrenocortical cells that have been transplanted into subrenal capsule can survive and secrete corticosterone and aldosterone， the subrenal capsule is a good position for transplantation of adrenocortical cell.
[Key Words]rat，adrenocortical cell，subrenal capsule，allotransplantation
腎上腺皮質(zhì)功能減退者可用激素替代治療，但需終身服藥，劑量難以掌控，且單純用糖皮質(zhì)激素不能彌補腎上腺所有激素的短缺，特別是沒(méi)有應急能力，因此，目前認為腎上腺移植仍然是治療慢性腎上腺皮質(zhì)功能減退最理想的方法[1]。
但由于器官來(lái)源困難及移植后的免疫排斥，其臨床效果，特別是遠期療效不甚滿(mǎn)意。
而腎上腺細胞移植有細胞來(lái)源豐富、可長(cháng)期保存和細胞的弱免疫原性的特點(diǎn)，可成為治療腎上腺皮質(zhì)功能不全的理想方法。
本實(shí)驗將體外培養的腎上腺細胞進(jìn)行腎被膜下移植，為臨床應用腎上腺細胞移植提供實(shí)驗依據。
1 材料與方法
1.1 實(shí)驗動(dòng)物和耗材
成年雄性Wistar大鼠(武漢大學(xué)醫學(xué)院實(shí)驗動(dòng)物中心提供)40只，體質(zhì)量200～250g，2周齡Wistar大鼠(提供處同上)60只。
膠原酶Ⅰ型、DNA酶、胰蛋白酶、DMEM/F_12培養基、3_(4，5_二甲基_2_噻唑)_2，5_二苯基溴化四唑(四甲基偶氮唑藍，MTT)、胎牛血清(Sigma公司，美國)，皮質(zhì)酮酶免法試劑盒(DSL公司，美國)，醛固酮放免試劑盒(中國原子能研究院同位素研究所，中國)。
1.2 腎上腺細胞體外培養與移植方法
無(wú)菌切取2周齡大鼠的雙側腎上腺，D_Hank?s液洗滌數次后去除附于腺體表面的血跡，在無(wú)菌罩內小心剔除腎上腺周?chē)�，剪�?mm×1mm×1mm碎塊，置于質(zhì)量濃度1g/L�、裥湍z原酶、質(zhì)量濃度5mg/L DNA酶的消化液中37℃水浴振蕩消化20min，待溶液呈粘糊狀時(shí)加入適量含小牛血清的培養基終止消化反應，400目鋼絲網(wǎng)過(guò)濾，收集濾液200g離心10min，棄上清液，Hank?s液、DMEM/F_12培養基依次各洗滌2次，200g離心10min收集細胞。
于DMEM/F_12培養基中重懸，反復吹打使細胞均勻分散呈單細胞懸液，細胞計數，調細胞濃度，錐蟲(chóng)藍染色計數細胞存活率>95%，然后接種至無(wú)菌培養瓶37℃、體積分數95%的O2、體積分數5%的CO2培養，原代培養1周后進(jìn)行細胞移植。
5_乙基_5_(1_甲基丁基)_2，4，6(1H，3H，5H)_噻啶三酮_鈉鹽(戊巴比妥鈉溶液，質(zhì)量濃度30mg/kg)腹腔麻醉，對照組(10只)行雙側腎上腺切除術(shù)，實(shí)驗組(20只)行雙側腎上腺切除術(shù)+腎被膜下細胞移植：沿左腎上腺切除術(shù)的切口將腎臟外置，于左腎下極鈍性分離腎被膜建立被膜下腔隙，將細胞懸液注入腔隙內，然后用鈦夾關(guān)閉腎被膜，每只大鼠移植2×106個(gè)腎上腺細胞;假手術(shù)組(10只)僅暴露腎臟后關(guān)閉切口。
術(shù)后1周肌注激素替代治療以減少術(shù)后死亡率，術(shù)后飲NS。
術(shù)后第2、4、6、8周8：00～9：00 AM內齜采血測血漿皮質(zhì)酮、醛固酮質(zhì)量濃度，采血后取移植體行光鏡檢查。
1.3 統計學(xué)處理
以±s表示，組間差異用t檢驗。
2 結果
2.1 腎上腺細胞分泌功能
對照組平均存活8.2d，術(shù)后2周血漿皮質(zhì)酮、醛固酮質(zhì)量濃度顯著(zhù)下降，術(shù)后8周實(shí)驗組血漿皮質(zhì)酮質(zhì)量濃度約為假手術(shù)組的80%，血漿醛固酮水平恢復較慢，術(shù)后4周血漿醛固酮質(zhì)量濃度僅為假手術(shù)組的10%，術(shù)后8周實(shí)驗組血漿醛固酮質(zhì)量濃度與假手術(shù)組比仍有統計學(xué)意義(P<0.05，表1、2)。
表1 血漿皮質(zhì)酮質(zhì)量濃度與對照組和假手術(shù)組比 1)P<0.05;與假手術(shù)組比 2)P<0.05 D表示動(dòng)物已死亡或檢測低于試劑盒的檢測范圍表2 血漿醛固酮質(zhì)量濃度(與對照組和假手術(shù)組比 1)P<0.05;與假手術(shù)組比 2)P<0.05 D表示動(dòng)物已死亡或檢測低于試劑盒的檢測范圍
2.2 腎上腺細胞移植病理結果
2、4周腎被膜下鏡下可見(jiàn)散在細胞團塊附著(zhù)在腎實(shí)質(zhì)表面，有少許形成組織團塊，腎上腺細胞呈圓形或多角形，胞體大，細胞質(zhì)透明，內有許多大小規則的顆粒(圖1，封2);6周腎被膜下肉眼可見(jiàn)黃、白色組織，與腎實(shí)質(zhì)緊密相連，鏡下可見(jiàn)血管明顯從腎實(shí)質(zhì)長(cháng)入，且周?chē)羞B接組織與腎實(shí)質(zhì)和腎被膜連接，未見(jiàn)炎癥細胞浸潤;8周見(jiàn)組織已被明顯血管化，細胞呈條索狀生長(cháng)，未見(jiàn)炎癥細胞浸潤(圖2，封2)。
3 討論
腎上腺是一個(gè)實(shí)質(zhì)內分泌器官，其主要功能是分泌糖皮質(zhì)激素和鹽皮質(zhì)激素，進(jìn)行細胞移植時(shí)不需要過(guò)多考慮其解剖結構的重建，僅僅需要它能分泌肌體所必需的激素即可。
而且與傳統器官移植相比，細胞移植可以利用細胞體外擴增技術(shù)，以少量細胞擴增到細胞移植所需要的量，解決器官移植供體來(lái)源不足的難題，在低溫條件下，待移植的細胞可以在體外長(cháng)期保存，而待移植的器官保存時(shí)間則相對較短，并且體外培養可以改變細胞的免疫原性和抗原性，減少免疫排斥反應發(fā)生的可能或減輕免疫排斥反應發(fā)生的程度[2]。
本實(shí)驗結果顯示，實(shí)驗組術(shù)后血漿皮質(zhì)酮、醛固酮質(zhì)量濃度逐漸上升，血漿皮質(zhì)酮質(zhì)量濃度術(shù)后2周與對照組比有統計學(xué)意義(P<0.05)，且血漿皮質(zhì)酮質(zhì)量濃度在術(shù)后8周能達到假手術(shù)組的80%(P<0.05)，說(shuō)明移植細胞進(jìn)入大鼠體內，移植細胞能存活，且隨移植時(shí)間的延長(cháng)移植細胞的功能狀態(tài)逐漸恢復。
但血漿醛固酮的恢復較慢，術(shù)后8周也只有假手術(shù)組的30%，這與大多數報道一致。
可能與移植后球狀帶細胞逐漸喪失醛固酮分泌功能而具有皮質(zhì)酮分泌功能有關(guān)[3]。
移植細胞的存活在很大程度上取決于移植部位。
腎被膜下腎上腺細胞移植滿(mǎn)足以下幾個(gè)條件：血供豐富，細胞移植成功與否關(guān)鍵在于移植后的第1周，血供能否建立是成敗的核心[4];便于移植操作;接近腎上腺正常的解剖部位。
細胞移植不同于器官移植，異位移植會(huì )因為細胞所處的內環(huán)境改變而致移植細胞不能長(cháng)期存活。
缺點(diǎn)是移植操作較復雜，如果能結合腹膜后腹腔鏡技術(shù)，移植操作過(guò)程將大大簡(jiǎn)化。
本實(shí)驗發(fā)現鼠腎被膜下腎上腺細胞移植能夠提供其機體所必需的糖皮質(zhì)激素和鹽皮質(zhì)激素，與參考文獻[5]結果一致。
實(shí)驗組血漿皮質(zhì)酮質(zhì)量濃度在術(shù)后6周明顯超過(guò)術(shù)后8周的(P<0.05)，與病理結果對照可發(fā)現術(shù)后6周血管從腎實(shí)質(zhì)長(cháng)入移植體，可能與其分泌的糖皮質(zhì)激素通過(guò)新生血管大量入血有關(guān)。
腎上腺皮質(zhì)分泌血管內皮生長(cháng)因子(VEGF)，促腎上腺皮質(zhì)激素不僅調節皮質(zhì)激素的合成，還在體內促進(jìn)腎上腺皮質(zhì)細胞分泌VEGF，可見(jiàn)充分的血供對腎上腺保持功能非常重要。
實(shí)驗表明，VEGF、成纖維生長(cháng)因子、轉移生長(cháng)因子_β、血小板衍生生長(cháng)因子、血管生成素_1均參與了血管形成[6]。
移植細胞的免疫原性是影響移植效果的重要因素之一，一般認為移植前將細胞在適當條件下培養，可降低移植物的免疫原性，減輕排斥反應，同時(shí)腎上腺細胞分泌的糖皮質(zhì)激素本身可抑制免疫排斥反應，因為大鼠腎被膜下是一個(gè)免疫特許部位。
本實(shí)驗組在2、4周細胞團塊及6周、8周帶有血管的組織均沒(méi)有見(jiàn)到明顯的炎性細胞浸潤。
證明腎被膜下也是同種異體腎被膜下腎上腺細胞移植的免疫裸區。
雖然腎上腺細胞移植在短短的10余年時(shí)間取得了長(cháng)足的進(jìn)步，但移植細胞的長(cháng)期存活、功能恢復和免疫排斥難題一直困擾著(zhù)人們。
為解決這些問(wèn)題，本實(shí)驗通過(guò)大鼠腎上腺細胞腎被膜下移植進(jìn)行有益嘗試，并找到更好的移植途徑，但移植細胞功能替代及遠期效果還有待進(jìn)一步研究。
【參考文獻】
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