低氧條件下大鼠視網(wǎng)膜葡萄糖調節蛋白的表達

【摘要】  目的 研究低氧條件下葡萄糖調節蛋白(grp78)在大鼠視網(wǎng)膜中的表達情況,探討內質(zhì)網(wǎng)應激在視網(wǎng)膜低氧條件下的作用及其機制。方法 Wistar大鼠30只,隨機分為正常對照組和實(shí)驗組,正常對照組飼養于常氧環(huán)境中,實(shí)驗組飼養于低氧倉。實(shí)驗組又按照在低氧倉飼養時(shí)間分為6、12、24、48和72 h等5個(gè)亞組,并于這5個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死大鼠,摘除眼球,應用免疫組織化學(xué)方法和RT?PCR法測定各組大鼠grp78蛋白表達。結果 grp78在正常大鼠視網(wǎng)膜中少量表達,低氧條件下6 h開(kāi)始升高,24 h到達高峰,72 h降至正常水平。低氧條件下6、12、24、48 h表達量與正常對照組比較差異有顯著(zhù)性(F=32.22,q=5.32～11.53,P＜0.05);72 h 視網(wǎng)膜grp78的表達與正常對照組相比,差異無(wú)顯著(zhù)性(q=2.79,P >0.05)。結論 低氧條件下grp78在大鼠視網(wǎng)膜中表達,它參與了大鼠視網(wǎng)膜低氧損傷的發(fā)生機制。 
【關(guān)鍵詞】  葡萄糖調節蛋白;視網(wǎng)膜;缺氧;大鼠,Wistar
　�。跘BSTRACT］ Objective To investigate the expression of glucose regulated protein (grp78) under hypoxia and to study the effect and mechanism of endoplasmic reticulum stress.  Methods Thirty wistar rats were randomly divided into normal control group and experimental group. The rats in the experimental group were killed after hypoxia breeding for 6, 12, 24, 48 and72 hours, respectively; the eyeballs were then removed. The expression of grp78 was studied immunohistochemically and by using reverse transcriptase PCR (RT?PCR). Results Expression of  grp78 was weak in normal retina, but increased after 6 hours of hypoxia, reached its peak after 24 hours of hypoxia and fell back to the normal level after 72 hours. The differences in expressions of grp78 in the rats after hypoxia breeding for 6, 12, 24 and 48 hours were significant, compared with that of control group (F=32.22;q=5.32-11.53;P<0.05). The difference between breeding of 72 h group and the control group was not significant (q=2.79,P>0.05). Conclusion grp78 is strongly expressed in rat retina under hypoxia and involves in the mechanism of retinal hypoxic injury.
    ［KEY WORDS］ glucose regulated protein; retinal; anoxia; rats, Wistar
    低氧使細胞的生理功能發(fā)生改變， 造成全身組織和器官失灌而損傷。內質(zhì)網(wǎng)應激是指在缺血、低氧或氧化應激等各種因素使細胞內質(zhì)網(wǎng)生理功能紊亂時(shí),細胞啟動(dòng)的自我保護反應機制,它有利于細胞內環(huán)境穩態(tài)的恢復和維持細胞存活[1]。近年來(lái)對于內質(zhì)網(wǎng)應激與全身多種疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系研究較多。視網(wǎng)膜結構復雜而且代謝旺盛,對低氧等刺激敏感,本實(shí)驗觀(guān)察大鼠視網(wǎng)膜低氧不同時(shí)間內質(zhì)網(wǎng)應激標志物——葡萄糖調節蛋白(grp78)在視網(wǎng)膜組織中的表達變化，探討內質(zhì)網(wǎng)應激在大鼠低氧條件下的作用。
　　1  材料和方法
　　1.1  實(shí)驗材料
    成年Wistar 大鼠30 只，雌雄不限,體質(zhì)量為220～250 g，由青島大學(xué)醫學(xué)院實(shí)驗動(dòng)物中心提供， 室溫飼養。兔抗鼠grp78 多克隆抗體(美國Stressgen公司),免疫組織化學(xué)Biotin SP2HRP Kit(北京中杉公司),Trizol(Invitrogen公司),M2MLV 逆轉錄酶、rTaq 酶(Takara 公司), 引物設計合成由大連寶生物公司完成。
　　1.2  低氧模型的建立及實(shí)驗分組
    用有機玻璃（厚度4 cm）制成低氧倉，體積為100 cm×60 cm×60 cm，三氯甲烷封側面，倉體上面開(kāi)一直徑1 cm的出氣孔，側面開(kāi)一直徑1 cm的進(jìn)氣孔，通過(guò)三通管分別接氮氣和壓縮空氣。用玻璃轉子流量計（沈陽(yáng)市北量流量?jì)x器廠(chǎng)）控制流量。Wistar大鼠30只，隨機分為正常對照組（n=5）和實(shí)驗組（n=25），正常對照組飼養于常氧環(huán)境中，實(shí)驗組飼養于氧體積分數為0.05的低氧倉。實(shí)驗組又按照在低氧倉飼養時(shí)間分為6、12、24、48和72 h等5個(gè)亞組，并于這5個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死大鼠(每次5只)，摘除眼球。常規方法制備組織石蠟標本。分別用免疫組織化學(xué)染色方法和RT?PCR法測定grp78的表達。
　　1.3  免疫組織化學(xué)染色
    石蠟切片常規脫蠟復水，按照免疫組織化學(xué)試劑盒說(shuō)明行SP法染色,陰性對照采用PBS代替一抗。顯微鏡下觀(guān)察視網(wǎng)膜組織中g(shù)rp78的表達情況,染色陽(yáng)性反應物質(zhì)表現為棕黃色顆粒,每組標本取5張切片,每張切片取5個(gè)視野,數碼照相機采集圖像,用Image?pro?plus 6.0圖像分析軟件測定細胞平均吸光度(A)值。
　　1.4  逆轉錄多聚酶鏈式反應(RT?PCR)
　　1.4.1  總RNA提取 
　　大鼠處死后立即摘除眼球,沿角鞏膜緣撕除角膜,小心撥除晶狀體和玻璃體,完整分離視網(wǎng)膜組織,研磨后加入1 mL的trizol,提取總RNA,紫外線(xiàn)分光光度計測定RNA含量。
　　1.4.2  RT反應 
　　按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。
　　1.4.3  PCR反應 
　　grp78引物序列為:上游5′?AGCCCACCGTAACAAT2CAAG?3′,下游5′?TCCAGCCATTCGATCTTTTC?3′,預計擴增片段長(cháng)度445 bp,β?actin用作內參照(片段長(cháng)度265 bp)，引物合成參照文獻[2]方法。反應條件:95 ℃預變性3 min; 95 ℃變性45 s,55 ℃退火45 s,72 ℃延伸60 s,共30個(gè)循環(huán);最后72 ℃再延伸10 min。取5 μL PCR產(chǎn)物,以12 g/L瓊脂糖凝膠電泳分離目的基因片段,溴化乙錠染色,紫外線(xiàn)燈下觀(guān)察并攝片,經(jīng)圖像分析系統測定A值,應用半定量法進(jìn)行g(shù)rp78 mRNA定量測定,以基因產(chǎn)物A值和內參照A值比表示。
　　1.5  統計學(xué)處理
    采用 SPSS 11.5和PPMS 1.5[3]統計分析軟件進(jìn)行數據處理,結果以±s表示,數據間比較采用單因素方差分析及SNK?q檢驗。
　　2  結 果
　　2.1  各組視網(wǎng)膜中g(shù)rp78表達的比較
    對照組大鼠視網(wǎng)膜組織grp78弱陽(yáng)性表達,主要分布于視網(wǎng)膜節細胞層和內核層。低氧條件 6 h grp78的表達開(kāi)始升高,仍表達在視網(wǎng)膜節細胞層和內核層，與對照組相比差異有顯著(zhù)性(q=5.32,P<0.05);12 h即可見(jiàn)grp78表達明顯增多(q=9.37,P<0.01);grp78的表達高峰出現在24 h(q=15.14,P<0.01);48 h grp78表達開(kāi)始下降,但仍高于正常對照組(q=11.53,P<0.01)；72 h組grp78的表達與正常對照組相比，差異無(wú)統計學(xué)意義(q=2.80,P>0.05)。 見(jiàn)表1。
　　2.2  RT?PCR檢測
    grp78 mRNA與內參照GAPDH mRNA的擴增產(chǎn)物片段長(cháng)度分別為445、265 bp，與預期相符。內參照基因擴增產(chǎn)物均明顯可見(jiàn)，各組視網(wǎng)膜組織grp78 mRNA的RT?PCR產(chǎn)物電泳結果見(jiàn)圖1。半定量分析的結果顯示,對照組大鼠視網(wǎng)膜組織中g(shù)rp78 mRNA有少量表達。低氧12 h即可見(jiàn)grp78 mRNA表達明顯增多（F=183.61，q=7.83,P<0.01）；grp78 mRNA的表達高峰出現在24 h(q=32.33,P<0.01）；48 h grp78 mRNA表達開(kāi)始下降，但仍高于對照組(q=23.48,P<0.01）；72 h grp78 mRNA的表達與正常對照組相比，差異無(wú)統計學(xué)意義(q=0.34,P>0.05）。見(jiàn)表1。表1  各組視網(wǎng)膜中g(shù)rp78及grp78 mRNA表達的比較（略）　
　　3  討 論
    視網(wǎng)膜是高度分化的神經(jīng)組織，中樞神經(jīng)系統對低氧最敏感，在人體的感官系統中，視網(wǎng)膜的代謝非常旺盛，主要由有氧代謝提供能量，對低氧的耐受性最低，機體內血氧的濃度及其彌散入組織的水平對維持視網(wǎng)膜組織的正常生理功能起著(zhù)重要的作用。大量的研究表明，低氧對視網(wǎng)膜的神經(jīng)元損傷，尤其是神經(jīng)節細胞的損傷明顯[4]。早在1988年,DAVID發(fā)現處于低氧環(huán)境中的雞胚胎視網(wǎng)膜內核層、內網(wǎng)狀層及神經(jīng)節細胞層受損。低氧24 h可導致視網(wǎng)膜所有類(lèi)型的細胞數明顯下降[5]。

    有研究表明，低氧導致的視網(wǎng)膜神經(jīng)節細胞損傷與內質(zhì)網(wǎng)應激反應的發(fā)生有關(guān)。內質(zhì)網(wǎng)應激反應是細胞的一種自我保護性機制,以恢復內質(zhì)網(wǎng)穩態(tài),維持生存。但是過(guò)強或長(cháng)時(shí)間的內質(zhì)網(wǎng)應激反應可以引起細胞凋亡。一些損傷因素如低氧、 葡萄糖或氨基酸等營(yíng)養物質(zhì)不足,肽鏈在內質(zhì)網(wǎng)中折疊受阻,內質(zhì)網(wǎng)中分泌蛋白超負荷、病毒感染、 基因突變、 內質(zhì)網(wǎng)與胞質(zhì)間鈣離子濃度差失調等都可成為內質(zhì)網(wǎng)應激的重要誘因[6]。細胞為了生存產(chǎn)生針對內質(zhì)網(wǎng)應激的反應,稱(chēng)為內質(zhì)網(wǎng)應激反應。grp78又名免疫球蛋白重鏈結合蛋白(bip)，被認為是內質(zhì)網(wǎng)應激反應的標志性分子，其生理狀態(tài)下表達很低，主要功能是作為分子伴侶參與新生多肽鏈的折疊、裝配和轉運；在缺血、低氧、低糖、氧化應激、鈣離子失衡等不利環(huán)境應激下引起內質(zhì)網(wǎng)應激反應，導致大量多肽鏈在內質(zhì)網(wǎng)內變性、積聚，此時(shí)grp78的表達量顯著(zhù)增高，一方面協(xié)助變性蛋白進(jìn)行重新折疊、裝配及跨膜轉運，緩解內質(zhì)網(wǎng)壓力；另一方面將無(wú)法恢復的蛋白質(zhì)轉移給蛋白降解系統降解，從而避免細胞進(jìn)一步受到傷害，它提高了細胞在應激情況下的生存能力和促進(jìn)應激后的細胞康復[7]。
    一些眼底疾病如糖尿病性視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞(缺血型)、視網(wǎng)膜中央動(dòng)脈阻塞等, 可導致視網(wǎng)膜組織低氧[8]。在理論上，內質(zhì)網(wǎng)應激反應參與了視網(wǎng)膜低氧性病變的發(fā)病機制。本實(shí)驗構建視網(wǎng)膜低氧模型，觀(guān)察大鼠低氧條件下不同時(shí)間段grp78的表達變化。結果顯示,在正常視網(wǎng)膜組織中g(shù)rp78少量表達,主要分布在 RGC層和內核層,低氧條件下6 h grp78 mRNA和蛋白表達均升高,24 h表達升高達到高峰,48 h后表達有所下降。表明低氧條件生存24 h時(shí)內質(zhì)網(wǎng)自穩系統的調節作用達到最佳水平,低氧條件生存后48 h grp78的表達下降可能與低氧細胞的內質(zhì)網(wǎng)穩態(tài)恢復有關(guān),也可能是由于內質(zhì)網(wǎng)自穩系統遭到了破壞,不能通過(guò)增加grp78的表達來(lái)結束內質(zhì)網(wǎng)應激狀態(tài),細胞啟動(dòng)了凋亡通路。本研究結果提示，grp78的動(dòng)態(tài)表達可能與低氧導致的視網(wǎng)膜損傷的進(jìn)展密切相關(guān),同時(shí)也提示了一種通過(guò)誘導內源性grp78生成來(lái)延緩低氧導致的視網(wǎng)膜損傷發(fā)展的新思路。低氧導致的視網(wǎng)膜損傷的發(fā)病機制是多因素、多途徑的結果,若早期在內質(zhì)網(wǎng)應激環(huán)節上加以干預,有可能為延緩低氧導致的視網(wǎng)膜損傷的發(fā)展提供新的治療途徑。
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